【摘要】：雞馬立克氏病(Marek’s disease,MD)是由馬立克氏病毒(Marek’disease virus,MDV)引起的免疫抑制和淋巴細(xì)胞腫瘤性禽病。近年來,盡管MD可用商品化的疫苗來保護(hù),但MD的不斷爆發(fā)已導(dǎo)致MDV的毒力增強(qiáng),其致病性也逐漸增大,MD仍然是一個(gè)嚴(yán)重的威脅,給世界養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,需要增強(qiáng)現(xiàn)有疫苗的控制措施以及尋找新的替代策略。宿主MicroRNA(miRNA)在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平發(fā)揮多種生物學(xué)功能,它們可能在誘導(dǎo)MD腫瘤形成過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。我們前期以自主培育的B21(抗性)和B19(易感)單倍型SPF雞為模型,利用高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了B21和B19雞在MDV病毒感染三個(gè)關(guān)鍵階段(5、14和25dpi)脾臟組織miRNA的差異表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)gga-miR-7b顯著差異表達(dá)。因此,我們以gga-miR-7b作為研究目標(biāo)進(jìn)行深入研究。(一)利用Targetscan和miRDB兩個(gè)生物學(xué)軟件分別預(yù)測(cè)gga-miR-7b的靶基因,取二者交集并結(jié)合GO分析篩選與腫瘤、免疫等相關(guān)的靶基因,共篩選出5個(gè)候選靶基因(VDAC1、KLF4、SATB1、SNCA、TCF12)。(二)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析上述候選靶基因在B21、B19單倍型SPF雞MDV感染三個(gè)關(guān)鍵階段(5、14和25dpi)脾臟組織的表達(dá)變化規(guī)律。通過qRTPCR結(jié)果分析,我們選取VDAC1、KLF4、SNCA進(jìn)行候選靶基因驗(yàn)證。(三)利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行g(shù)ga-miR-7b的候選靶基因體外驗(yàn)證,結(jié)果顯示:gga-miR-7b可以結(jié)合到VDAC1、SNCA的mRNA 3’UTR區(qū),抑制螢火蟲熒光素酶活性(p0.05)。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),gga-miR-7b抑制VDAC1基因的mRNA和蛋白表達(dá)(p0.05)。上述結(jié)果證實(shí)了VDAC1是gga-miR-7b調(diào)控的靶基因。(四)運(yùn)用CCK-8和Transwell小室實(shí)驗(yàn)分析gga-miR-7b和VDAC1對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞的增殖和遷移的影響。結(jié)果顯示:gga-miR-7b可抑制MDCC-MSB1細(xì)胞的增殖和遷移(p0.05);利用siRNA敲低VDAC1后,MDCC-MSB1細(xì)胞的增殖則受到了抑制(p0.05),同時(shí)降低了MDCC-MSB1細(xì)胞的遷移,盡管沒有達(dá)到顯著水平。更有趣的是,敲低VDAC1后,MDV致瘤基因Meq的mRNA表達(dá)也受到了顯著抑制(p0.05)。綜上所述,本研究證實(shí)了VDAC1是gga-miR-7b調(diào)控的功能靶基因,并且gga-miR-7b可能通過調(diào)控VDAC1抑制MDCC-MSB1細(xì)胞的增殖和遷移。gga-miR-7b及其調(diào)控的靶基因VDAC1很可能與MD腫瘤形成及MDV感染有關(guān)。
【圖文】：

圖 1-1 馬立克氏病發(fā)病機(jī)制的四個(gè)階段Fig.1-1 Four stages of the pathogenesis of Marek's disease1.1.2 雞馬立克氏病的防控現(xiàn)狀自 1907 年首次報(bào)道 MD，隨后在美國(guó)、英國(guó)和荷蘭等國(guó)家檢測(cè)到了 MD 的發(fā)生案例[18]。值得注意的是，在致癌性皰疹病毒病原學(xué)發(fā)現(xiàn)之后，在 20 世紀(jì) 70 年代早期開發(fā)了一種能有效防控 MD 的疫苗，特別是活的 HVT 疫苗[19-20]。20 世紀(jì) 70 年代后期，由于田間菌株毒力的增加導(dǎo)致更多的 MD 爆發(fā)，直到 20 世紀(jì) 80 年代開始使用二價(jià)疫苗（SB-1+HVT）和后來減毒血清型 1 Rispens/CV1988 疫苗[21-22]。所有這些都是與細(xì)胞相關(guān)的病毒性疫苗。MD 疫苗是世界上第一種能夠預(yù)防病毒誘發(fā)的癌癥疫苗[23]。減毒 Rispens 疫苗是通過血清型1 MDV 的連續(xù)體外傳代開發(fā)的，該過程是用已知降低 MDV 毒株在體內(nèi)生長(zhǎng)的能力以及擴(kuò)增病毒基因組的 IR 區(qū)域中的串聯(lián)直接重復(fù)序列構(gòu)成[24]。Rispens 疫苗是迄今為止對(duì)抗 MDV超強(qiáng)毒株（vv）和超超強(qiáng)毒株（vv+）最有效的疫苗，對(duì)易感禽類的接種是安全的，用 HVT和 SB-1 接種鳥也可以預(yù)防 MD，但通常對(duì) vv 和 vv+菌株的效果較差。通常在孵化后或卵內(nèi)施用 MD 疫苗以允許雛雞在成年雞群中暴露于病毒之前被免疫（該過程需要 7 至 14 天以后獲得完全保護(hù)）。目前疫苗接種策略的一個(gè)主要缺陷是它們不產(chǎn)生無(wú)菌免疫，即在接種疫

UTR）中發(fā)現(xiàn)的部分互補(bǔ)序列的相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)。目前，miRBase 中了在 223 種物種中發(fā)現(xiàn)的超過 35,000 種 miRNA，其中在人類中發(fā)現(xiàn)了大約 2500 種 m（miRBase，版本 21）。每個(gè) miRNA 被預(yù)測(cè)調(diào)節(jié)許多靶標(biāo)，通常每個(gè) miRNA 有超過個(gè)可能的靶標(biāo)[27]；另一方面，一個(gè)基因可能受多個(gè) miRNA 的調(diào)控，為 miRNA 基因調(diào)絡(luò)增加了另外一層復(fù)雜性。miRNA 可以源自多種 RNA 分子，其可以以不同方式調(diào)節(jié)錄，但是通過保守途徑加工以形成成熟的 miRNA。內(nèi)含子 miRNA 是從那些已知基因含子序列中產(chǎn)生的，而基因間 miRNA 是從基因間區(qū)域產(chǎn)生的。較長(zhǎng)的初始 miRNA 初錄物（pri-miRNA）由 RNA 聚合酶 II 和 III 直接從基因組 DNA 產(chǎn)生。轉(zhuǎn)錄后，每個(gè)miRNA 形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾，其由 RNA 酶 III 酶 Drosha 進(jìn)一步加工以產(chǎn)生前體 m（pre-miRNA）。然后，Exportin-5 將 pre-miRNA 從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。在這里，，它另一種酶 RNA III 酶加工，Dicer 和 Argonaute 蛋白（人類中的 AGO1-AGO4）結(jié)合并RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）。解鏈后，一條 miRNA 鏈被降解，剩下的一條成為的 miRNA[28-30]。miRNA 通常通過與其靶 mRNA 轉(zhuǎn)錄物的 3'-UTR 序列發(fā)生不完全或完堿基互補(bǔ)配對(duì)來調(diào)節(jié) mRNA 靶標(biāo)。miRNA 和靶標(biāo)結(jié)合的雜交效率由種子序列決定miRNA 5'-末端內(nèi)覆蓋 2-7 個(gè)核苷酸的一段 6 個(gè)核苷酸[31]。如圖 1-2 所示，miRNA 通過mRNA 的 3’端非編碼區(qū)（3’UTR）相互作用或影響 mRNA 的翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用，在多種疾病中發(fā)揮生物學(xué)功能[32]。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.31

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