【摘要】：山羊副流感病毒3型(caprine parainfluenza virus type 3,CPIV3)是2013年發(fā)現(xiàn)的一種新病毒,主要導(dǎo)致羊呼吸道疾病,山羊感染率高達(dá)56%,而綿羊感染情況尚未見(jiàn)報(bào)道。CPIV3致病力較強(qiáng),傳播速度快,給養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展帶來(lái)了新的威脅。目前對(duì)CPIV3研究較少,缺乏對(duì)其復(fù)制、感染、傳播和致病機(jī)制的深入認(rèn)識(shí),在該病防控中缺乏理論支撐。因此,本研究在明確CPIV3在綿羊中流行態(tài)勢(shì)的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)地研究了外泌體和自噬在CPIV3復(fù)制、傳播及維持細(xì)胞微環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮的重要作用。為評(píng)價(jià)CPIV3在我國(guó)綿羊主產(chǎn)區(qū)的流行情況,本研究從抗體和病原兩個(gè)方面分別對(duì)2012年的1,163份和2016~2017年的1,863份綿羊血清樣品進(jìn)行檢測(cè),抗體陽(yáng)性率分別為50.3%(585/1,163)和64.9%(1,210/1,863),病原陽(yáng)性率為21.5%(401/1,863)。說(shuō)明綿羊普遍存在CPIV3感染。所鑒定的11株CPIV3毒株經(jīng)M基因和全基因組序列進(jìn)化分析顯示,綿羊CPIV3和山羊CPIV3親緣關(guān)系極近,具有高度同源性。為鑒定外泌體攜帶的信息物質(zhì),首先用超速離心法結(jié)合CD63免疫磁珠法純化CPIV3感染的MDBK細(xì)胞外泌體,經(jīng)外泌體分子標(biāo)志檢測(cè)、形態(tài)觀察、粒徑分析和蔗糖密度梯度離心分析,證明所獲囊泡符合外泌體特征,且CPIV3感染可促進(jìn)細(xì)胞分泌外泌體。然后經(jīng)蛋白質(zhì)譜、Western blot、小RNA測(cè)序和qRT-PCR鑒定發(fā)現(xiàn),CPIV3外泌體(CPIV3-exo)攜帶病毒蛋白、病毒RNA以及miRNA,且外泌體對(duì)裝載的miRNA具有明顯選擇性。靶基因預(yù)測(cè)及分析顯示,CPIV3感染相關(guān)miRNA的靶基因參與調(diào)控細(xì)胞自噬相關(guān)通路。為進(jìn)一步分析外泌體在CPIV3感染中的作用,將PKH67標(biāo)記的CPIV3-exo與MDBK細(xì)胞共孵育,熒光觀察證明細(xì)胞可主動(dòng)攝入外泌體。CPIV3-exo處理MDBK細(xì)胞后,經(jīng)檢測(cè)病毒蛋白和RNA發(fā)現(xiàn),CPIV3-exo可介導(dǎo)病毒生產(chǎn)性感染,且病毒復(fù)制效率高于CPIV3,但其感染可被CPIV3陽(yáng)性血清所阻斷。檢測(cè)自噬標(biāo)志分子LC3B和p62的結(jié)果顯示,CPIV3-exo與CPIV3均可抑制細(xì)胞自噬。而且,與CPIV3感染組相比,細(xì)胞因子IFN-α和oas1表達(dá)水平顯著下調(diào)。說(shuō)明CPIV3-exo通過(guò)抑制細(xì)胞自噬和細(xì)胞因子的表達(dá)更有效地介導(dǎo)病毒生產(chǎn)性感染。那么,自噬是否與CPIV3復(fù)制相關(guān)?經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后檢測(cè)病毒復(fù)制水平,發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)外病毒蛋白顯著下降,而RNA水平升高。進(jìn)一步純化細(xì)胞的外泌體并檢測(cè)其標(biāo)志蛋白,結(jié)果顯示,誘導(dǎo)自噬后細(xì)胞分泌的外泌體減少,而外泌體中攜帶的病毒蛋白和RNA增加。Western blot檢測(cè)表明,誘導(dǎo)自噬的細(xì)胞內(nèi)CD63和HSP70表達(dá)水平均顯著下降,且與CPIV3滴度呈正相關(guān)。說(shuō)明誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后,不但使CPIV3復(fù)制水平降低,而且抑制外泌體的形成和釋放,還促進(jìn)病毒蛋白和RNA進(jìn)入MVBs。為進(jìn)一步探究CPIV3感染中自噬與外泌體形成和釋放之間的關(guān)系,用外泌體抑制劑GW4869處理CPIV3感染細(xì)胞,抑制外泌體的分泌,發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶的病毒蛋白和RNA水平也隨之降低。但CD63和病毒F蛋白蓄積在細(xì)胞內(nèi),且二者可共定位。說(shuō)明抑制細(xì)胞外泌體的釋放,使病毒蛋白隨MVBs滯留于細(xì)胞內(nèi)。Western blot分析、熒光檢測(cè)和電鏡觀察還發(fā)現(xiàn),在CPIV3感染情況下抑制外泌體分泌,可促進(jìn)細(xì)胞自噬。綜上所述,CPIV3感染在綿羊和山羊中普遍存在,且毒株具有極高同源性;CPIV3在細(xì)胞內(nèi)增殖過(guò)程中,病毒、外泌體與自噬之間存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。CPIV3感染可抑制細(xì)胞自噬,但促進(jìn)外泌體分泌,外泌體被靶細(xì)胞攝入后可介導(dǎo)高效的生產(chǎn)性感染;誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,可抑制CPIV3復(fù)制及外泌體的形成和釋放;而抑制外泌體分泌時(shí),自噬水平升高,且大量病毒蛋白和RNA儲(chǔ)存于MVBs中并隨之蓄積于細(xì)胞內(nèi)。自噬與外泌體途徑在CPIV3感染中過(guò)程中互相平衡,這種調(diào)控機(jī)制維持了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,在CPIV3的高效復(fù)制、傳播中發(fā)揮重要作用。上述研究結(jié)果不僅有助于闡明CPIV3感染和傳播機(jī)制,而且對(duì)深入研究病毒與宿主相互作用機(jī)制,制訂科學(xué)合理的防控措施具有重要意義。
【圖文】：

.1 外泌體攜帶不同蛋白、RNA 和脂類（Harendra S, et al. Virusig. 1.1 Exosomes contain specific repertoires of proteins, RNAs an白之外，外泌體還攜帶不同的 RNA 進(jìn)入受體細(xì)胞。豐富，占原始測(cè)序讀數(shù)的 42.32%，占匹配成功讀數(shù)的核糖體 RNA（rRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（lncRNA））等其它種類 RNA（圖 1.1）。外泌體 miRNA 運(yùn)送到

圖 1.3 自噬與外泌體分泌之間的關(guān)系(Baixauli et al., 2014)Fig. 1.3 Interaction between autophagy and exosome release pathways在巨自噬過(guò)程中，MVBs 可以選擇與細(xì)胞膜融合進(jìn)入外泌體分泌途徑，或與溶酶體噬途徑。研究證明 ESCRT 突變與自噬和 MVB 形成息息相關(guān)，ESCRT 突變后，自噬內(nèi)體系統(tǒng)發(fā)生膜融合，從而不能形成完全自噬(Rusten et al., 2007)。通過(guò)構(gòu)建不同 ES
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.27

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本文編號(hào)：2650004