【摘要】：禽致病性大腸桿菌(Avianpathogenic Escherichia coli,APEC)是引起鵝大腸桿菌病的重要病原菌之一,可導(dǎo)致雛鵝的大腸桿菌性敗血癥,成年鵝卵黃性腹膜炎,嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。由于細(xì)菌耐藥性問題日益突出,疫苗免疫接種是預(yù)防和控制鵝大腸桿菌病的較為理想方案,而目前尚無商品化疫苗。糖酵解是細(xì)菌體內(nèi)基礎(chǔ)代謝之一,aroA基因編碼的3-磷酸烯醇丙酮�；Р菟�-5-磷酸合成酶(EPSPS),是細(xì)菌糖酵解中間產(chǎn)物莽草酸代謝途徑關(guān)鍵酶,為細(xì)菌體內(nèi)生存所必須。前期有研究將病原細(xì)菌aroA基因敲除作為疫苗使用,取得良好效果。本研究利用λ-Red同源重組技術(shù)構(gòu)建鵝源致病性大腸桿菌aroA基因缺失株,在探索其生物學(xué)特性和致病力基礎(chǔ)上,評估該基因缺失菌株作為疫苗候選株的潛力。具體研究內(nèi)容如下:(1)根據(jù)GenBank上所登錄的APEC aroA基因序列,設(shè)計一對引物,用以PCR擴(kuò)增APEC臨床分離株G8107菌株aroA基因和序列鑒定。進(jìn)一步根據(jù)此試驗菌株aroA序列設(shè)計一對λ-Red同源重組系統(tǒng)試驗用缺失引物,其5'端與aroA序列兩側(cè)同源,而3'端與氯霉素抗性基因cat表達(dá)盒同源�；讦�-Red同源重組系統(tǒng),以質(zhì)粒pKD3為模板擴(kuò)增出的含有氯霉素抗性的PCR產(chǎn)物,經(jīng)純化后,導(dǎo)入含有質(zhì)粒pKD46的G8107菌株,在Red同源重組酶的作用下,氯霉素抗性基因片段借助兩翼同源序列與染色體上的靶基因發(fā)生重組,將aroA基因置換下來,通過氯霉素抗性篩選平板篩選陽性重組子,即獲得一次重組菌。在二次重組中,一次重組菌電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20,通過對cat閱讀框兩側(cè)的FRT位點的識別,從而消除抗性基因。最后通過PCR特異性檢測以及DNA測序結(jié)果,驗證G8107△aroA缺失株的成功構(gòu)建。將攜帶編碼有aroA基因全長的表達(dá)重組質(zhì)粒pBR322-aroA導(dǎo)入缺失株構(gòu)建回補(bǔ)株G8107△aroA/pararoA。(2)進(jìn)一步分析G8107△aroA基因缺失株的生物學(xué)特性和致病力。相關(guān)生物學(xué)特性研究結(jié)果表明,缺失株分解發(fā)酵糖類和氨基酸的能力以及運動能力與野生株沒有差異;缺失株在對數(shù)生長期的生長速度慢于野生株,穩(wěn)定期趨于同一水平;體外黏附試驗結(jié)果表明,相比于野生株,G8107AaroA缺失株對雞成纖維細(xì)胞系DF-1的黏附能力下降35%(p0.01);體外生物被膜定量試驗結(jié)果表明,與野生株相比,缺失株生物被膜形成能力降低72%(p0.01);通過qRT-PCR試驗檢測aroA基因缺失株中相關(guān)毒力因子表達(dá)情況。結(jié)果表明,與野生株相比,缺失株中表達(dá)溶血素亞單位的hlyA基因表達(dá)量下降2%(p0.05),編碼血清抗性蛋白的iss基因表達(dá)量下降11.0%(p0.05),編碼溫敏性血凝素tsh基因表達(dá)量下降8.3%(p0.05),而回補(bǔ)株在上述參數(shù)指標(biāo)均得到了部分恢復(fù)。(3)G8107AaroA缺失株感染雛鵝致病力分析和免疫效果初步評測。為進(jìn)一步探究△aroA缺失株致病性能力,建立2日齡雛鵝感染試驗?zāi)Ｐ?分別將G8107野生株、△aroA缺失株、△aroA/paroA回補(bǔ)株經(jīng)翅下注射107、108、109 cfu/mL菌液0.5 mL感染雛鵝,通過改良寇氏法計算得出G8107野生株、△aroA缺失株和△aroA/paroA回補(bǔ)株的LD50分別為 5.96×108cfu、23.7×108cfu和 16.8×108cfu�！鱝roA缺失株 LD50 是野生株的 3.98 倍,表明aroA基因缺失能夠顯著降低大腸桿菌毒力。為進(jìn)一步評價G8107△aroA減毒株對雛鵝感染的免疫保護(hù)效果,建立雛鵝攻毒免疫保護(hù)試驗?zāi)Ｐ�。�?0只7日齡雛鵝隨機(jī)分成A、B、C、D和E五組,每組各10只。C、D、E組分別以口服免疫108、109、1010 cfu/mL G8107△aroA減毒株菌液,B組口服等量PBS,A組為空白對照組,免疫劑量均為0.5 mL/只。2周后采用同樣的劑量和途徑進(jìn)行二次免疫。二免2周后以1010cfu/mL進(jìn)行APEC野生株氣囊攻毒0.5 mL菌液,于攻毒后第10天處死剩余鵝并進(jìn)行病理剖檢。免疫保護(hù)試驗結(jié)果顯示:免疫G8107△aroA的C、D、E三組攻毒后出現(xiàn)死亡鵝只數(shù)分別為4、2、2,而免疫PBS的B組死亡只數(shù)為8;相比于B組,C、D、E三組雛鵝死亡率分別下降40%、60%、60%。剖檢診斷與顯微病理學(xué)檢查結(jié)果顯示,G8107△aroA減毒株三個免疫組較PBS免疫組的組織器官病變明顯減輕。以上結(jié)果證明免疫G8107△aroA重組減毒株對雛鵝APEC感染具有較好的保護(hù)效果。綜上,本研究成功構(gòu)建了鵝源大腸桿菌aroA基因缺失菌株,并對其生物學(xué)特進(jìn)行研究,證實了 aroA基因缺失能夠引起菌株毒力的顯著下降,評估了 aroA基因缺失菌株作為疫苗候選株的潛力。
【圖文】：

以質(zhì)粒ｐＫＤ３為模板，缺失引物ｐ３、ｐ４擴(kuò)增出含有氯霉素抗性打耙片段，兩端與ａｒｏ／１逡逑基因上下游同源，經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小約為１１００ｂｐ，與預(yù)期大小相一致。如逡逑圖１－１所示：逡逑Ｍ邋１逡逑Ｓｉｚｅ逡逑０＞ｐ）邋Ｉ逡逑２０００邋Ｂ邋＇邋｜邐…逡逑１，Ｊ，ｊ逡逑Ｍ邋：邋Ｔｒａｎｓ邋１５Ｋ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ逡逑１邋：邐ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ逡逑圖１－１．融合ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定逡逑Ｍ邋：邋Ｔｒａｎｓ邋１５Ｋ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋１：含邋ａｒｏＪ邋同源序列的邋ＰＣＲ邋產(chǎn)物逡逑Ｆｉｇ邋１－１．邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃａｔ邋ｇｅｎｅ邋ｉｎ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＫＤ３邋ｗｉｔｈ邋ａｒｏＡ邋ｈｏｍｏｌｏｇｙ邋ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ逡逑Ｍａｒｋｅｒ：Ｔｒａｎｓ邋１５Ｋ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋１：ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ逡逑３．２第一次重組菌Ｇ８１０７Ａｆｌｒｏ４：：ｃＷ的ＰＣＲ鑒定逡逑將在Ａｍｐ＋和Ｃｍ＋雙抗性平板上生長的單克隆煮沸法制備模板，用基因鑒定引逡逑物卩１、口２進(jìn)行？0１鑒定。結(jié)果顯示0８１０７野生株r潰ǎ蘩┰銎未笮∥保玻叮村澹第啵淮沃劐義獻(xiàn)樘宕笮∥保常矗埃猓皰澹ㄈ繽跡保菜荊，

本文編號：2649338