【摘要】：未分化的精原細(xì)胞是存在于雄性睪丸內(nèi)的成體干細(xì)胞,具有維持自我更新和分化產(chǎn)生精子的能力,是雄性體內(nèi)源源不斷地產(chǎn)生精子的基礎(chǔ)。對其生物學(xué)特性的研究有助于理解精子發(fā)生的過程,揭示雄性生殖系干細(xì)胞自我更新和分化的機制。但是,未分化精原細(xì)胞在睪丸中數(shù)量稀少,且缺少特異性的分子標(biāo)記,嚴(yán)重阻礙了其相關(guān)研究與應(yīng)用。有研究報道,磷脂酶D家族成員6(PLD6)在小鼠未分化精原細(xì)胞表達。為了鑒定PLD6能否作為豬未分化精原細(xì)胞的分子標(biāo)記,本研究旨在探究豬雄性生殖細(xì)胞中PLD6的表達分布特點,從而優(yōu)化其富集方法,提高純化效率。同時,嘗試建立一個豬的未分化精原細(xì)胞的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系,為雄性生殖干細(xì)胞的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:(1)采集初生期、初情期和成年期的不同物種的睪丸組織,通過免疫組織化學(xué)技術(shù)PLD6在睪丸組織中的表達及分布。結(jié)果表明PLD6在性成熟前豬睪丸的精原細(xì)胞中特異性表達,且PLD6在小鼠、山羊和公牛的睪丸中的表達模式與其在豬上的表達模式一致。(2)通過PLD6與已知分子標(biāo)記的免疫雙熒光染色檢測性成熟前的豬睪丸組織中表達PLD6蛋白的細(xì)胞類型。結(jié)果表明,PLD6在豬未分化精原細(xì)胞中特異性表達。(3)采取兩步酶消化法和差異貼壁對性成熟前豬睪丸細(xì)胞進行初步的富集,臺盼藍染色結(jié)果表明細(xì)胞活率為95%。接著采用PLD6標(biāo)記通過MACS進一步富集未分化精原細(xì)胞。通過Western Blot,qRT-PCR,流式分析鑒定分選前后的細(xì)胞類群。流式細(xì)胞分析表明,PLD6~+細(xì)胞富集了約8.5倍的未分化精原細(xì)胞。QRT-PCR、Western Blot結(jié)果表明,精原干細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)記在PLD6~+細(xì)胞中高表達,而在PLD6~-細(xì)胞和未分選細(xì)胞中低表達;相反,體細(xì)胞相關(guān)的分子標(biāo)記則在PLD6~-細(xì)胞和未分選細(xì)胞中高表達。這證明PLD6可作為性成熟前豬未分化精原細(xì)胞的分子標(biāo)記,用于富集豬的未分化精原細(xì)胞。(4)異種移植鑒定PLD6~+細(xì)胞的生物學(xué)功能,并比較富集效率。將PLD6~+細(xì)胞和未分選細(xì)胞用PKH26熒光染料進行標(biāo)記并分別移植到百消安處理的受體小鼠睪丸中,8周后采集受體睪丸組織檢測曲細(xì)精管中帶有熒光標(biāo)記的細(xì)胞克隆數(shù)目。結(jié)果表明PLD6~+細(xì)胞可在受體睪丸曲細(xì)精管中定植并增殖,產(chǎn)生的克隆數(shù)目是未分選細(xì)胞產(chǎn)生的克隆數(shù)目的9倍,表明PLD6~+細(xì)胞富含精原干細(xì)胞。(5)體外無飼養(yǎng)層條件下培養(yǎng)PLD6~+細(xì)胞,并鑒定細(xì)胞類型。通過建立一個無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系,可以在體外培養(yǎng)PLD6~+細(xì)胞,維持未分化狀態(tài)4周時間,并在整個培養(yǎng)期間表達未分化精原細(xì)胞的分子標(biāo)記。表明PLD6~+細(xì)胞仍具有干細(xì)胞特征。綜上所述,本研究表明PLD6可以作為豬未分化精原細(xì)胞的表面分子標(biāo)記物,可用于高效富集性成熟前豬的未分化精原細(xì)胞。本項研究發(fā)現(xiàn)為進一步研究豬未分化精原細(xì)胞的體外培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ),也為后續(xù)PLD6在其它物種雄性生殖細(xì)胞上的研究提供了理論參考。
【圖文】：

未分化精原細(xì)胞中的 Asingle精原細(xì)胞是 SSCs(Olive and Cuzin細(xì)胞間胞質(zhì)橋連接形成鏈狀的 Apaired、Aaligened精原細(xì)胞在 Asingle缺失時能胞并去分化形成 Asingle，以維持干細(xì)胞數(shù)量和恢復(fù)精子發(fā)生過程 (Brinrmann 1994; De Rooij 2017; Yoshida 2012)。故廣義上也可認(rèn)為 A 型精原細(xì)原細(xì)胞是 SSCs。之后 A 型精原細(xì)胞發(fā)生分化依次形成 In 型、B 型精原細(xì)，再經(jīng)過減數(shù)分裂產(chǎn)生圓形精細(xì)胞，最后生成精子。而在靈長類動物中，胞則分為 Adark和 Apale(Boitani et al. 2016; Ehmcke et al. 2006a; Ehmc。Adark精原細(xì)胞是儲備型干細(xì)胞，只在青春期間和外在因素導(dǎo)致精原細(xì)胞恢復(fù)精原干細(xì)胞的自我更新 (Simorangkir et al. 2005)。相反，Apale精原細(xì)周期有規(guī)律地進行自我更新和增殖，是 SSCs 的主要成分 (Ehmcke et ae et al. 2005b)。然而，這一主張仍有爭議，有待進一步研究。但不可否認(rèn)的有限分裂對精子發(fā)生產(chǎn)生了巨大的影響，不同物種之間差異顯著。例如的 A 型精原細(xì)胞能分裂產(chǎn)生數(shù)千個精細(xì)胞；而在人類中，一個 A 型精原最多產(chǎn)生 40 個精細(xì)胞(Di Persio et al. 2017)。圖 1-1 總結(jié)了嚙齒動物和靈長過程的差異 (Schlatt and Ehmcke 2014)。

精原干細(xì)胞的微環(huán)境（niche）參與調(diào)控了精原2015）。Niche 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是支持細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞組ne 2007)。其中，支持細(xì)胞是一類極化柱狀上皮細(xì)胞，，通信號以支持精子發(fā)生和生殖細(xì)胞分化(Griswold 1998)。成血睪屏障（BTB），將生精上皮分為基底區(qū)和近腔區(qū)中起重要作用 (Cheng and Mruk 2002)。BTB 維持腔內(nèi)性物質(zhì)流動，從而為在生精小管的近腔區(qū)的單倍體生殖外，將正常的支持細(xì)胞移植到不育受體的睪丸中發(fā)現(xiàn)受精子發(fā)生，證明了支持細(xì)胞對生殖細(xì)胞分化的重要性(Katsu-Shinohara et al. 2003b)。在小鼠中，將從胚胎不同階丸 niche 中，能在曲細(xì)精管定植甚至產(chǎn)生精子，具有生05; Nayernia et al. 2005; Ohta et al. 2004)。這些發(fā)現(xiàn)表明生殖細(xì)胞提供了獨特的微環(huán)境。但是 niche 的具體的細(xì)和分子功能尚不完全清楚。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S828

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

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2 尹明,李德雪;體外培養(yǎng)條件下SCF、LIF與bFGF對昆明白小鼠精原干細(xì)胞增殖的影響[J];生物工程學(xué)報;2002年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 于雪;水牛精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定及轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞的異種移植[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

本文編號：2646321