發(fā)布時間：2020-04-30 14:02

【摘要】：豬繁殖與呼吸障礙綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起嚴(yán)重威脅豬養(yǎng)殖業(yè)的傳染病之一。20世紀(jì)80年代末至90年代初,該病最早在美國和歐洲等國家暴發(fā)和流行。PRRSV的主要特點(diǎn)是變異快、重組率高,這給PRRSV的防控帶來巨大的挑戰(zhàn),而詳盡研究并了解PRRSV的生物學(xué)特性,對于PRRSV的防控具有重要意義。根據(jù)生物信息學(xué)的預(yù)測與實(shí)驗(yàn)證實(shí),PRRSV ORF1a區(qū)與ORF1b區(qū)共編碼14個非結(jié)構(gòu)蛋白(Nsp)(Fang and Snijder,2010)(Fang and Snijder,2010)。其中Nsp1與PRRSV的亞基因組mRNAs的合成相關(guān)。Nsp2與Nsp3參與復(fù)制相關(guān)復(fù)合體DMVs(double membrane vesicles)的形成。目前研究認(rèn)為,PRRSV病毒的復(fù)制在DMVs上進(jìn)行。Nsp4編碼3C樣絲氨酸蛋白酶。除此之外,Nsp1α/β、Nsp2、Nsp4和Nsp11被證實(shí)與PRRSV抑制天然免疫信號通路相關(guān)。ORF1b區(qū)域編碼4個Nsps(Nsp9至Nsp12),Nsp9是RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp),Nsp10是RNA解旋酶,已經(jīng)有相關(guān)的報道證實(shí)Nsp9與Nsp10是高致病性PRRSV的致病基礎(chǔ)。Nsp11具有核酸內(nèi)切酶活性與去泛素化酶活性,此外Nsp11具有抑制NLRP3炎癥小體與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。在整個ORF1b區(qū)域,唯有Nsp12的功能尚不明確,并未見其相關(guān)報道。Nsp12含153 aa,其分子量為17 kDa,位于ORF1b區(qū)末端,能夠提高IL-1β和IL-8的表達(dá)。除此之外,HSP70是研究比較明確的與Nsp12相互作用的蛋白質(zhì)。抑制HSP70的表達(dá)能夠顯著降低病毒mRNA的合成及病毒的復(fù)制。本研究主要對Nsp12對病毒復(fù)制的影響及相關(guān)的生化特性進(jìn)行分析。通過對不同PRRSV毒株間的Nsp12序列進(jìn)行保守性分析;在感染性克隆的基礎(chǔ)上構(gòu)建Nsp12的缺失病毒,探索其對復(fù)制的影響;對Nsp12二聚化的現(xiàn)象及二硫鍵的特性進(jìn)行相關(guān)的探索;在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的復(fù)制子系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,對Nsp12是否參與病毒RNA的合成等問題進(jìn)行相關(guān)的研究。研究表明,不同PRRSV毒株間Nsp12的氨基酸序列具有高度的保守性。Nsp12缺失不能夠拯救病毒,表明Nsp12參與進(jìn)PRRSV的復(fù)制并且對于PRRSV的復(fù)制至關(guān)重要。生化分析結(jié)果顯示Nsp12容易被氧化形成二聚體及多聚體,Nsp12與N蛋白的二聚體形成都是由于細(xì)胞裂解后空氣氧化形成二硫鍵,與N蛋白不同的是,Nsp12二聚體不存在于成熟的病毒粒子中。對Nsp12中3個半胱氨酸突變分析表明,第35位和79位Cys聯(lián)合突變不能拯救出病毒,說明第35位和79位Cys對于PRRSV的復(fù)制至關(guān)重要。最后,構(gòu)建了可以評價PRRSV負(fù)鏈RNA合成能力的復(fù)制子系統(tǒng),并通過該系統(tǒng)初步證明只有ORF1a和ORF1b共同表達(dá)時才會有效的啟動PRRSV負(fù)鏈RNA的合成,同時也初步證實(shí)Nsp12參與進(jìn)了病毒RNA的合成過程。本研究初步探索了Nsp12的生化特性及功能,將為該蛋白的生物學(xué)功能探索奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.1 PRRSV 粒子結(jié)構(gòu)模式圖(Lunney ethematic representation of PRRSV virion（Cited from物學(xué)特征單股正鏈 RNA，3′端有多聚腺苷酸的尾巴分別是 ORF1a、ORF1b 和 ORF2-7 區(qū)(SnijRF1a 和 ORF1b 主要編碼 PRRSV 的復(fù)制酶ins，Nsp）編碼區(qū)。ORF2-7 編碼病毒的結(jié)GP5、膜蛋白 M 和核衣殼蛋白 N (Meulenbl., 2000; Meulenberg, 2000; Murtaugh et al., 1成分是 GP5 和 M 蛋白，，它們由二硫鍵連 PRRSV 的感染性克隆中將編碼兩者的基因GP5 和 M 蛋白的主要功能是參與病毒結(jié)構(gòu) 的功能還涉及到病毒粒子最初與細(xì)胞的結(jié)多的研究表明 GP5 上含有中和表位，并且 1997)。此外 M 蛋白上也存在中和表位(Ya

農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一ten et al., 1996) 。此外，已有相關(guān)的報道證實(shí) Nsp1α/β、Nsp2、Nsp4 和 Nsp11 與 PRR免疫信號通路相關(guān)(Beura et al., 2010; Fang and Snijder, 2010; Li et al., 2010; Shi et et al., 2010; Yoo et al., 2010)。ORF1b 區(qū)域編碼 4 個 Nsps (Nsp9～12)，Nsp9 具有 RN 聚合酶（RdRp）的活性，Nsp10 具有 RNA 解旋酶的活性，楊漢春團(tuán)隊證實(shí) Nsp9 致病性 PRRSV 的致病基礎(chǔ)(Li et al., 2014)。Nsp11 具有核酸內(nèi)切酶活性與去泛素化酶., 2011; Wang et al., 2015)。此外，Nsp11 具有抑制 NLRP3 炎癥小體與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的., 2014)。據(jù)相關(guān)報道，Nsp3、Nsp5、Nsp6、Nsp7 和 Nsp8 非結(jié)構(gòu)蛋白與病毒毒力相., 2008)。盡管對 PRRSV 的研究非常廣泛，但我們?nèi)匀粚δ承┎《镜鞍椎慕Y(jié)構(gòu)和功尤其是非結(jié)構(gòu)蛋白 Nsp12。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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2 郭寶清,陳章水,劉文興,崔益洙;從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J];中國畜禽傳染病;1996年02期

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本文編號：2645840