【摘要】：嘔吐毒素(vomitoxin,VX)屬于B組單端孢霉烯族毒素,化學名稱為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的霉菌毒素中檢出率最高,被檢出含量最高的霉菌毒素。有報道稱,嘔吐毒素是對動物生產(chǎn)造成危害最大的毒素之一,目前我國對嘔吐毒素脫毒的方法多為物理處理,但因吸附毒素的同時還會吸附營養(yǎng)物質(zhì)而未被廣泛適用。近年來,益生性枯草芽胞桿菌多次被報道具有良好脫毒的效果而且還能發(fā)揮其自身益生性能,即在動物體內(nèi)穩(wěn)定脫毒的同時又能增強機體的腸道功能,保護腸道健康,現(xiàn)已成為極具發(fā)展?jié)摿Φ拿咕舅孛摱局苿�。本研究從來源于動物腸道及糞便的益生菌菌株中成功篩選出兼?zhèn)涿摱竟δ芗耙嫔阅艿目莶菅堪麠U菌菌株,并對其脫毒特性進行了初步研究,對其體內(nèi)外脫毒效果進行驗證,為研發(fā)脫毒型動物微生態(tài)制劑提供理論與技術(shù)支撐。1、益生菌菌株的篩選及鑒定以DON的類似物苯基環(huán)氧乙烷作為唯一碳元素來源對實驗室益生菌菌株進行初篩,初步篩選出可在DON環(huán)境下存活的菌株6株;再以純品DON為底物,通過脫毒復(fù)篩,選出對純品DON脫毒效果最好的菌株WXBs-042;對篩選出的菌株進行鑒定,通過形態(tài)學觀察、生化指標鑒定、16S rRNA gene鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析后,確定WXBs-042為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。2、枯草芽胞桿菌WXBs-042生物學特性的研究生長曲線結(jié)果表明,枯草芽胞桿菌WXBs-042在2h左右進入對數(shù)生長期,對數(shù)期為4h左右隨后進入穩(wěn)定期、衰退期。在抑菌性能方面,枯草芽胞桿菌WXBs-042 對沙門氏菌、大腸桿菌 K88、K99、0139、0157 有一定的抑菌活性,對金黃色葡萄球菌無抑菌活性。菌株耐受性結(jié)果表明,枯草芽胞桿菌WXBs-042能耐受高溫、模擬胃液及0.3%膽鹽等條件。3、枯草芽胞桿菌WXBs-042脫毒特性的研究枯草芽胞桿菌WXBs-042脫毒特性的研究結(jié)果表明,枯草芽胞桿菌WXBs-042對DON的脫毒效果與作用時間呈正相關(guān)關(guān)系;枯草芽胞桿菌WXBs-042對DON的脫毒效果與脫毒環(huán)境的pH無關(guān);枯草芽胞桿菌WXBs-042發(fā)酵液不同處理組對DON的脫毒效果不同,其中發(fā)酵滅活菌處理組脫毒效果最好,脫毒率達72.16%;針對菌體-DON復(fù)合物穩(wěn)定性的評價試驗,證明該復(fù)合物穩(wěn)定性良好。初步判定枯草芽胞桿菌WXBs-042脫毒方式為少量發(fā)酵上清降解脫毒及菌體吸附脫毒的雙重作用。4、動物試驗效果驗證動物試驗方案:空白對照組、陰性對照組、益生菌組、攻毒組、混合組、預(yù)防Ⅰ組、預(yù)防Ⅱ組及治療組。采用集中按時灌胃的方式進行DON及益生菌的灌胃,分別在試驗第14d和第28d集中剖檢采樣,分析各組BALB/c小鼠的生產(chǎn)性能、血清生化指標、觀察肝臟及空腸切片的變化,分析WXBs-042在動物體內(nèi)脫毒的效果及其益生的作用。1.各組BALB/c小鼠的生產(chǎn)性能結(jié)果表明,灌服WXBs-042能顯著提高未灌胃DON的BALB/c小鼠的體重和平均日增重(P0.05),提高BALB/c小鼠的生產(chǎn)性能;DON攻毒顯著降低小鼠體重、平均日增重(P0.05);灌服WXBs-042菌懸液能緩解DON中毒對BALB/c小鼠體重、平均日增重的影響(P0.05)。2.血清生化指標結(jié)果表明,益生菌組BALB/c小鼠的血清生化指標與空白、陰性對照組相比無顯著差異(P0.05);DON攻毒組BALB/c小鼠的血清生化指標中ALT、AST指標顯著高于各對照組(P0.05),而WXBs-042的添加可以顯著緩解中毒現(xiàn)象(P0.05)。3.通過對肝臟制作病理切片并觀察,發(fā)現(xiàn)WXBs-042菌株的灌胃不會對BALB/c小鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)造成損傷;DON破壞BALB/c小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu),導(dǎo)致炎性細胞浸潤、肝細胞破裂溶解等病理學變化,WXBs-042菌株的加入能緩解該現(xiàn)象。4.空腸病理切片觀察發(fā)現(xiàn),DON破壞BALB/c小鼠空腸絨毛組織結(jié)構(gòu),可見上皮細胞脫落及腸絨毛變短等現(xiàn)象,WXBs-042菌株的灌胃會促進空腸絨毛生長同時緩解其它攻毒DON試驗組空腸絨毛被破壞現(xiàn)象的發(fā)生。以上結(jié)果表明,WXBs-042既可以發(fā)揮益生作用,提高BALB/c小鼠的生產(chǎn)性能;又可以在動物體內(nèi)發(fā)揮脫毒作用,有效緩解DON對BALB/c小鼠造成的損傷,同時預(yù)防Ⅱ組是最佳預(yù)防方式。
【圖文】：

邐華中農(nóng)業(yè)大學２０１９屆碩士研宄生學位論文邐逡逑用孔雀石綠燃料對其芽胞狀態(tài)進行染色，用光學顯微鏡油鏡觀察到的結(jié)果，兩項結(jié)逡逑果表明，，菌株ＷＸＢｓ－０４２為革蘭氏陽性細菌，長桿狀，呈成對或鏈狀排列形式，孢逡逑子呈中生、近中生狀態(tài)，無莢膜。逡逑

以菌株ＷＸＢＳ－０４２的基因組作為起始擴增模板，利用細菌１６ＳｒＲＮＡｇｅｎｅ通逡逑用特異引物進行ＰＣＲ擴增，瓊脂糖凝膠電泳法初步檢測擴增產(chǎn)物，產(chǎn)物大小約１．５ｋ逡逑ｂｐ。圖４－４為擴增產(chǎn)物電泳圖譜。逡逑Ｍ邋！邐２逡逑ｍｄ邋■＊．．逡逑５０００ｂｐ—＞邋ｇ逡逑３０００ｂ邋ｐ逡逑２000ｂ＾＾＾Ｈ＜－１４１９ｂｐ逡逑１０００ｂｐ￣＞邐，；＾邋，；；Ｖｖ邋＾逡逑■逡逑圖４－４邋１６Ｓ邋ｒＲＮＡ邋ｇｅｎｅ擴增產(chǎn)物電泳圖譜逡逑Ｆｉｇ．邋４－４邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋１６Ｓ邋ｒＲＮＡ邋ｇｅｎｅ逡逑對ＰＣＲ擴增產(chǎn)物片段進行回收處理并送測序，結(jié)果如圖４－５所示。將獲得逡逑的１６Ｓ邋ｒＲＮＡ邋ｇｅｎｅ測序結(jié)果序列登錄到ＮＣＢＩ上進行Ｂｌａｓｔ序列比對，序列同源逡逑性分析結(jié)果為菌株ＷＸＢｓ－０４２與枯草芽胞桿菌（價（：／／／奶５＾／也５）的同源性為９９％逡逑以上。逡逑ＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＧＴＴＡＧＣＧＧＣＧＧ逡逑ＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＴＡＡＧＡＣＴＧＧＧＡＴＡＡＣＴＣＣＧＧＧ逡逑ＡＡＡＣＣＧＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＧＡＴＧＧＴＴＧＴＴＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＴＡＡＡ逡逑ＡＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＴＴＡＣＡＧＡＴＧＧＡＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧ逡逑ＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＧＧＣＴＣＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＴＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡ逡逑ＴＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧ
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.6

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本文編號：2644958