【摘要】：MicroRNAs(miRANs)是一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼小RNA分子,具有重要的生理調(diào)控功能。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn),miR-148a在泌乳期和非泌乳期水牛乳腺組織中的表達(dá)有顯著差異,且證明其靶基因為DNMT1,表明甲基化表觀遺傳修飾可能與乳腺的生理功能調(diào)控有關(guān)。為進(jìn)一步了解甲基化修飾對乳腺上皮細(xì)胞功能狀態(tài)的調(diào)控作用,本研究探討了miR-148a和甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dc對水牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及其泌乳相關(guān)基因表達(dá)的影響,取得如下研究結(jié)果。1.水牛乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定。采用泌乳期的水牛乳腺組織塊進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng),并用胰酶消化差異法分離純化水牛乳腺上皮細(xì)胞。采用免疫熒光、細(xì)胞核型分析、油紅O染色對其鑒定,繪制生長曲線。結(jié)果顯示,組織塊培養(yǎng)法可成功獲得水牛乳腺上皮細(xì)胞,純化的乳腺細(xì)胞具有典型上皮細(xì)胞的形態(tài)特征,具有分泌乳脂的能力,能在體外傳代培養(yǎng)20代。2.調(diào)控miR-148a基因表達(dá)對水牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及泌乳相關(guān)基因表達(dá)的影響。(1)為篩選miR-148a對水牛乳腺上皮細(xì)胞的合適處理濃度,通過非脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染miR-148a模擬物和抑制劑到乳腺上皮細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞,采用qRT-PCR檢測靶基因DNMT1的表達(dá)。結(jié)果顯示,在miR-148a過表達(dá)組中,DNMT1的表達(dá)隨著模擬物濃度的增大而逐漸降低,與陰性對照組相比,50nMmiR-148a模擬物可以顯著降低DNMT1的表達(dá)(P0.05);在miR-148a抑制組中,DNMT1的表達(dá)隨著抑制劑濃度的增大而逐漸升高,與陰性對照組相比,30nMmiR-148a抑制劑可以顯著提高DNMT1 的表達(dá)(P0.05)。(2)采用 50nMmiR-148a 模擬物和 30nM miR-148a抑制劑分別處理水牛乳腺上皮細(xì)胞48 h,檢測其對細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響及對細(xì)胞周期蛋白CyclinDl及mTOR、PparG、Srebpl等泌乳相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與陰性對照組相比,過表達(dá)miR-148a可以顯著提高水牛乳腺上皮細(xì)胞的活力(P0.05)、增加有絲分裂S期細(xì)胞的比例、提高CyclinD1基因和泌乳關(guān)鍵基因PparG、Srebp1、Fabp3的表達(dá)(P0.05);抑制miR-148a表達(dá)可以顯著降低水牛乳腺上皮細(xì)胞的活力(P0.05)、增加有絲分裂G1期細(xì)胞的比例,降低S、G2期細(xì)胞的比例、CyclinD1、Srebp1、Glut1 和 Fabp3 基因的表達(dá)顯著降低(P0.05)。3.5-Aza-dc處理對水牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及泌乳相關(guān)基因表達(dá)的影響。(1)為篩選5-Aza-dc處理水牛乳腺上皮細(xì)胞的合適濃度,在細(xì)胞培養(yǎng)液中分別添加 0.1μM/L、0.5μM/L、1μM/L、5μM/L 的 5-Aza-dc,72h 后收集細(xì)胞,采用qRT-PCR檢測DNMT1基因的表達(dá)。結(jié)果顯示,與空白組相比,添加 0.5 μM/L、1 μM/L、5 μM/L 5-Aza-dc 組中,DNMT1 基因的表達(dá)量均顯著降低(P0.05),故選擇低濃度0.5 μM/L5-Aza-dc進(jìn)行后續(xù)試驗。(2)以0.5 μM/L 5-Aza-dc處理乳腺細(xì)胞72 h,采用CCK8試劑盒檢測其對細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀檢測其對細(xì)胞周期的影響;qRT-PCR技術(shù)檢測其對細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、miR-148a基因及mTOR、PparG、Srebp1等泌乳相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,與空白組相比,添加0.5 μM/L 5-Aza-dc可以提高水牛乳腺上皮細(xì)胞的活力,增加有絲分裂S期細(xì)胞的比例,顯著提高CyclinD1、miR-148a、Srebp1、Csn1s1、Fabp3、E1f5 基因的表達(dá)(P0.05)。以上結(jié)果表明:miR-148a及DNA甲基化參與水牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖及調(diào)控泌乳相關(guān)基因的表達(dá),兩者與乳腺發(fā)育和泌乳密切相關(guān)。
【圖文】：

２．２免疫熒光法鑒定角蛋白１８邋（ＣＫ１８）的表達(dá)逡逑細(xì)胞免疫熒光法檢測第３代乳腺上皮細(xì)胞的ＣＫ１８的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水牛乳逡逑腺上皮細(xì)胞核呈紅色（圖１－２Ａ３、圖１－２Ｂ３），細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的細(xì)胞角蛋白１８呈綠色（圖逡逑卜２Ｂ２），陰性對照成纖維細(xì)胞無綠色熒光（圖１－２Ａ２），說明純化得到的細(xì)胞為乳腺逡逑上皮細(xì)胞。逡逑ｍ逡逑Ａ１邐Ａ２邐Ａ３逡逑ｍｍｍ逡逑Ｂ１邐Ｂ２邐Ｂ３逡逑圖１－２角蛋白１８鑒定水牛乳腺上皮細(xì)胞逡逑Ａ１－Ａ３：成纖維細(xì)胞（１００ｘ），Ａ１：常光，Ａ２：綠光，Ａ３：紅光；Ｂ１－Ｂ３：純化后的逡逑不規(guī)則乳腺上皮細(xì)胞（１００ｘ）邋，邋Ｂ１：常光，Ｂ２：綠光，Ｂ３：紅光；逡逑Ｆｉｇ．邋１邋－２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂｕｆｆａｌｏ邋ｍａｍｍａｒｙ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｉｔｈ邋ｋｅｒａｔｉｎ邋１８逡逑Ａ１－Ａ３：邋ｂｕｆｆａｌｏ邋ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ邋ｃｅｌｌ（１０0ｘ）邋，邋Ａ１邋：邋ｃｏｍｍｏｎ邋ｌｉｇｈｔ，邋Ａ２：邋ｇｒｅｅｎ邋ｌｉｇｈｔ，邋Ａ３：邋ｒｅｄ邋ｌｉｇｈｔ；逡逑Ｂ１－Ｂ３：邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ｉｒｒｅｇｕｌａｒ邋ｐｏｌｙｇｏｎａｌ邋ｍａｍｍａｒｙ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ邋（邋１００ｘ），邋Ｂ１邋：邋ｃｏｍｍｏｎ邋ｌｉｇｈｔ，邋Ｂ２：逡逑ｇｒｅｅｎ邋ｌｉｇｈｔ，邋Ｂ３邋：邋ｒｅｄ邋ｌｉｇｈｔ；逡逑２．３油紅Ｏ染色檢測

ＳＵＭＳ逡逑ＡＢＣ邐Ｄ逡逑圖１－１水牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)（ｌ00ｘ）逡逑Ａ：成纖維細(xì)胞；Ｂ：上皮樣細(xì)胞；Ｃ：長滿的細(xì)胞；Ｄ：純化后的乳腺上皮細(xì)胞逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｂｕｆｆａｌｏ邋ｂｒｅａｓｔ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌ邋ｉｎ邋ｃｕｌｔｕｒｅ逡逑Ａ：Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｇｒｏｗｎ邋ｆｒｏｍ邋ｍａｍｍａｒｙ邋ｔｉｓｓｕｅ；邋Ｂ：Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｇｒｏｗｎ邋ｆｒｏｍ邋ｍａｍｍａｒｙ逡逑ｔｉｓｓｕｅ；邋Ｃ：Ｃｅｌｌｓ邋ｆｕｌｌ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ邋ｐｅｔｒｉ邋ｄｉｓｈ；邋Ｄ：Ｐｕｒｉｅｄ邋ｍａｍｍａｒｙ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ逡逑２．２免疫熒光法鑒定角蛋白１８邋（ＣＫ１８）的表達(dá)逡逑細(xì)胞免疫熒光法檢測第３代乳腺上皮細(xì)胞的ＣＫ１８的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水牛乳逡逑腺上皮細(xì)胞核呈紅色（圖１－２Ａ３、圖１－２Ｂ３），細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的細(xì)胞角蛋白１８呈綠色（圖逡逑卜２Ｂ２），陰性對照成纖維細(xì)胞無綠色熒光（圖１－２Ａ２），說明純化得到的細(xì)胞為乳腺逡逑上皮細(xì)胞。逡逑ｍ逡逑Ａ１邐Ａ２邐Ａ３逡逑ｍｍｍ逡逑Ｂ１邐Ｂ２邐Ｂ３逡逑圖１－２角蛋白１８鑒定水牛乳腺上皮細(xì)胞逡逑Ａ１－Ａ３：成纖維細(xì)胞（１００ｘ），Ａ１：常光，Ａ２：綠光，Ａ３：紅光；Ｂ１－Ｂ３：純化后的逡逑不規(guī)則乳腺上皮細(xì)胞（１００ｘ）邋，邋Ｂ１：常光，，Ｂ２：綠光，Ｂ３：紅光；逡逑Ｆｉｇ．邋１邋－２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂｕｆｆａｌｏ邋ｍａｍｍａｒｙ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｉｔｈ邋ｋｅｒａｔｉｎ邋１８逡逑Ａ１－Ａ３：邋ｂｕｆｆａｌｏ邋ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ邋ｃｅｌｌ（１０0ｘ）邋
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2644879