【摘要】：蹄葉炎是奶牛普通疾病中較為常見的一種,奶牛發(fā)病易導(dǎo)致全身癥狀,使得產(chǎn)奶量降低,為奶牛養(yǎng)殖帶來經(jīng)濟損失。關(guān)于蹄葉炎的病因及機理有著許多假說和推測,但其真正機制并不十分明確。為進一步弄清這個問題,本試驗采用角叉菜膠對蹄真皮細胞進行處理,誘導(dǎo)并建立炎癥模型,然后用槲皮素對炎癥細胞進行治療,檢測對細胞中炎性介質(zhì)和相關(guān)通路蛋白的表達的影響,以及對細胞色素P450酶的影響,從細胞和分子的水平作為切入點,探討在蹄葉炎發(fā)病過程中,細胞內(nèi)有哪些變化。本研究中,分別采用組織塊貼壁法和雙酶消化法兩種方法來分離培養(yǎng)奶牛蹄部真皮細胞,以獲得生長良好的細胞。用角叉菜膠處理蹄細胞,通過MTT法測定細胞活力,收取細胞培養(yǎng)液,運用ELISA法檢測其中炎性介質(zhì)IL-1β、TNF-ɑ的水平,Western Blot法檢測p65 NF-κB和p38 MAPK蛋白的表達。結(jié)果顯示,隨著角叉菜膠濃度的升高,對細胞生長的抑制率也隨之升高,200μg/mL的角叉菜膠處理細胞后,對細胞生長的抑制率最接近10%。該濃度的角叉菜膠處理蹄真皮細胞48 h后,p65 NF-κB和p38 MAPK蛋白的表達升高,同時細胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量顯著高于對照組(P0.05)。因此,采用200μg/mL的角叉菜膠處理細胞48 h,能成功制造炎癥細胞模型。通過MTT法檢測槲皮素的細胞毒性,用PCR法檢測其是否會直接對細胞中CYP450酶的表達產(chǎn)生影響。結(jié)果表明,用濃度不高于100 mmol/L的槲皮素處理奶牛蹄部真皮細胞48 h后,沒有對細胞產(chǎn)生毒性,也未對CYP1A1、CYP3A4 mRNA的表達產(chǎn)生影響。以角叉菜膠建立細胞炎癥模型,用幾種不同濃度的槲皮素處理蹄真皮炎癥細胞,通過控制槲皮素添加到細胞中的時間將其分為兩個處理組,然后吸取細胞培養(yǎng)液,對照細胞處理前后,炎性介質(zhì)IL-1β和TNF-ɑ量的變化,裂解細胞提取其中的蛋白質(zhì),檢測槲皮素對p65 NF-κB和p38 MAPK兩個炎癥通路中的蛋白以及細胞色素P450酶的表達有何影響。根據(jù)結(jié)果得出,槲皮素可以減少炎癥細胞IL-1β、TNF-α的分泌;可抑制p65 NF-κB、p38 MAPK蛋白的表達;還可以解除角叉菜膠對CYP450酶蛋白表達的抑制,以30 mmol/L濃度治療效果最好。結(jié)論:運用雙酶消化法以及組織貼壁法均獲得生長良好的原代真皮細胞。以200μg/mL的角叉菜膠處理奶牛真皮細胞,作用48 h后能誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生炎癥,從而構(gòu)建炎癥模型。對于角叉菜膠誘導(dǎo)炎癥細胞產(chǎn)生的IL-1β以及TNF-α,槲皮素能夠顯著減少其生成量,同時還可以抑制信號通路p65 NF-κB和p38 MAPK蛋白的表達,減輕角叉菜膠對細胞色素P450酶的抑制作用,最佳治療濃度為30 mmol/L。
【圖文】：

形狀多為三角形或梭形（圖 1 A）。當培養(yǎng)到 9-10 d 時，有大量細胞呈放射狀或旋渦狀分散在組織塊周圍（圖1 B）。經(jīng)過 13 d 左右的培育后，可見細胞相互接觸。雙酶消化法：剛經(jīng)過膠原酶消化可見大量細胞懸�。▓D 1 C），細胞接種 48 h 后基本全部貼壁，體積變大，，4-5 d 后，細胞可遍布整個細胞板底，細胞走勢呈束狀或漩渦狀（圖 1 D）。A BC D注：A：培養(yǎng) 6 d 后組織塊周圍析出的原代細胞；B：培養(yǎng) 10 d 后細胞的排列分布；C：雙酶消化法的到的細胞懸液； D：雙酶消化法 5 d 后貼壁的細胞。Note: A: Primary cells deposited around the tissue block after 6 days of culture; B: Arrangement and distribution of cells after 10 days ofculture; C: Dermal cells suspension of double enzyme digestion; D: Adherent cells after 5 days of double enzyme digestion.3.2 蹄部真皮細胞炎癥模型的建立3.2.1 選擇角叉菜膠誘導(dǎo)炎癥模型的最適濃度MTT 法檢測細胞活力，結(jié)果表明，100 μg/mL 的角叉菜膠對細胞生長有輕微促進作用，當圖 1 分別采用兩種途徑培養(yǎng)到的原代蹄真皮細胞（標尺=150 μm）Fig. 1 Primary hoof dermal cells cultured in two ways

圖 2 角叉菜膠對蹄真皮細胞 p65NF-κB、p38MAPK 信號通路的影響Fig.2 The effects of Carrageenan on p65 NF-κB、p38MAPK in hoof dermal cells說明與對照組相比差異顯著（P<0.05），**說明與對照組比較差異極顯著（P<0.01）。There is a significant difference compared with the control group (P<0.05), ** indicates that the difference is extremely significanted with the control group. (P <0.01).
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23

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本文編號：2644401