【摘要】：蹄葉炎是奶牛普通疾病中較為常見的一種,奶牛發(fā)病易導(dǎo)致全身癥狀,使得產(chǎn)奶量降低,為奶牛養(yǎng)殖帶來經(jīng)濟(jì)損失。關(guān)于蹄葉炎的病因及機(jī)理有著許多假說和推測(cè),但其真正機(jī)制并不十分明確。為進(jìn)一步弄清這個(gè)問題,本試驗(yàn)采用角叉菜膠對(duì)蹄真皮細(xì)胞進(jìn)行處理,誘導(dǎo)并建立炎癥模型,然后用槲皮素對(duì)炎癥細(xì)胞進(jìn)行治療,檢測(cè)對(duì)細(xì)胞中炎性介質(zhì)和相關(guān)通路蛋白的表達(dá)的影響,以及對(duì)細(xì)胞色素P450酶的影響,從細(xì)胞和分子的水平作為切入點(diǎn),探討在蹄葉炎發(fā)病過程中,細(xì)胞內(nèi)有哪些變化。本研究中,分別采用組織塊貼壁法和雙酶消化法兩種方法來分離培養(yǎng)奶牛蹄部真皮細(xì)胞,以獲得生長良好的細(xì)胞。用角叉菜膠處理蹄細(xì)胞,通過MTT法測(cè)定細(xì)胞活力,收取細(xì)胞培養(yǎng)液,運(yùn)用ELISA法檢測(cè)其中炎性介質(zhì)IL-1β、TNF-ɑ的水平,Western Blot法檢測(cè)p65 NF-κB和p38 MAPK蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,隨著角叉菜膠濃度的升高,對(duì)細(xì)胞生長的抑制率也隨之升高,200μg/mL的角叉菜膠處理細(xì)胞后,對(duì)細(xì)胞生長的抑制率最接近10%。該濃度的角叉菜膠處理蹄真皮細(xì)胞48 h后,p65 NF-κB和p38 MAPK蛋白的表達(dá)升高,同時(shí)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量顯著高于對(duì)照組(P0.05)。因此,采用200μg/mL的角叉菜膠處理細(xì)胞48 h,能成功制造炎癥細(xì)胞模型。通過MTT法檢測(cè)槲皮素的細(xì)胞毒性,用PCR法檢測(cè)其是否會(huì)直接對(duì)細(xì)胞中CYP450酶的表達(dá)產(chǎn)生影響。結(jié)果表明,用濃度不高于100 mmol/L的槲皮素處理奶牛蹄部真皮細(xì)胞48 h后,沒有對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性,也未對(duì)CYP1A1、CYP3A4 mRNA的表達(dá)產(chǎn)生影響。以角叉菜膠建立細(xì)胞炎癥模型,用幾種不同濃度的槲皮素處理蹄真皮炎癥細(xì)胞,通過控制槲皮素添加到細(xì)胞中的時(shí)間將其分為兩個(gè)處理組,然后吸取細(xì)胞培養(yǎng)液,對(duì)照細(xì)胞處理前后,炎性介質(zhì)IL-1β和TNF-ɑ量的變化,裂解細(xì)胞提取其中的蛋白質(zhì),檢測(cè)槲皮素對(duì)p65 NF-κB和p38 MAPK兩個(gè)炎癥通路中的蛋白以及細(xì)胞色素P450酶的表達(dá)有何影響。根據(jù)結(jié)果得出,槲皮素可以減少炎癥細(xì)胞IL-1β、TNF-α的分泌;可抑制p65 NF-κB、p38 MAPK蛋白的表達(dá);還可以解除角叉菜膠對(duì)CYP450酶蛋白表達(dá)的抑制,以30 mmol/L濃度治療效果最好。結(jié)論:運(yùn)用雙酶消化法以及組織貼壁法均獲得生長良好的原代真皮細(xì)胞。以200μg/mL的角叉菜膠處理奶牛真皮細(xì)胞,作用48 h后能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥,從而構(gòu)建炎癥模型。對(duì)于角叉菜膠誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β以及TNF-α,槲皮素能夠顯著減少其生成量,同時(shí)還可以抑制信號(hào)通路p65 NF-κB和p38 MAPK蛋白的表達(dá),減輕角叉菜膠對(duì)細(xì)胞色素P450酶的抑制作用,最佳治療濃度為30 mmol/L。
【圖文】：

形狀多為三角形或梭形（圖 1 A）。當(dāng)培養(yǎng)到 9-10 d 時(shí)，有大量細(xì)胞呈放射狀或旋渦狀分散在組織塊周圍（圖1 B）。經(jīng)過 13 d 左右的培育后，可見細(xì)胞相互接觸。雙酶消化法：剛經(jīng)過膠原酶消化可見大量細(xì)胞懸浮（圖 1 C），細(xì)胞接種 48 h 后基本全部貼壁，體積變大，，4-5 d 后，細(xì)胞可遍布整個(gè)細(xì)胞板底，細(xì)胞走勢(shì)呈束狀或漩渦狀（圖 1 D）。A BC D注：A：培養(yǎng) 6 d 后組織塊周圍析出的原代細(xì)胞；B：培養(yǎng) 10 d 后細(xì)胞的排列分布；C：雙酶消化法的到的細(xì)胞懸液； D：雙酶消化法 5 d 后貼壁的細(xì)胞。Note: A: Primary cells deposited around the tissue block after 6 days of culture; B: Arrangement and distribution of cells after 10 days ofculture; C: Dermal cells suspension of double enzyme digestion; D: Adherent cells after 5 days of double enzyme digestion.3.2 蹄部真皮細(xì)胞炎癥模型的建立3.2.1 選擇角叉菜膠誘導(dǎo)炎癥模型的最適濃度MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果表明，100 μg/mL 的角叉菜膠對(duì)細(xì)胞生長有輕微促進(jìn)作用，當(dāng)圖 1 分別采用兩種途徑培養(yǎng)到的原代蹄真皮細(xì)胞（標(biāo)尺=150 μm）Fig. 1 Primary hoof dermal cells cultured in two ways

圖 2 角叉菜膠對(duì)蹄真皮細(xì)胞 p65NF-κB、p38MAPK 信號(hào)通路的影響Fig.2 The effects of Carrageenan on p65 NF-κB、p38MAPK in hoof dermal cells說明與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），**說明與對(duì)照組比較差異極顯著（P<0.01）。There is a significant difference compared with the control group (P<0.05), ** indicates that the difference is extremely significanted with the control group. (P <0.01).
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.23

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本文編號(hào)：2644401