發(fā)布時(shí)間：2020-04-29 05:42

【摘要】：陜北白絨山羊是我國重要的絨山羊品種,其羊絨具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。絨毛的周期性生長與毛囊干細(xì)胞及其毛乳頭細(xì)胞相互調(diào)控有著密切的聯(lián)系。本研究初步探究毛乳頭細(xì)胞來源外泌體對毛囊干細(xì)胞增殖分化的影響。首先在體外培養(yǎng)分離陜北白絨山羊毛囊干細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞來源外泌體;通過對毛囊干細(xì)胞與毛乳頭細(xì)胞共培養(yǎng)組和對照組進(jìn)行精準(zhǔn)定量轉(zhuǎn)錄組和mi RNA測序分析,以及對毛乳頭細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞來源外泌體進(jìn)行mi RNA測序分析,篩選出與毛囊干細(xì)胞增殖分化相關(guān)的關(guān)鍵基因及mi RNA;利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測毛乳頭細(xì)胞來源外泌體的mi R-22-5p和let-7b-5p與預(yù)測靶基因的靶向關(guān)系,并探究mi R-22-5p和let-7b-5p對毛囊干細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用。本研究取得主要研究結(jié)果如下:1.利用毛囊貼壁法成功分離出陜北白絨山羊毛囊干細(xì)胞,結(jié)合Ⅳ型膠原快速差異貼壁法和流式細(xì)胞分選法得到高純度的毛囊干細(xì)胞。通過顯微鏡和透射電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)所收集的細(xì)胞具有毛囊干細(xì)胞的特征;而且表達(dá)CD34,K15和ITGβ1等毛囊干細(xì)胞的分子標(biāo)記;成功建立毛囊干細(xì)胞與毛乳頭細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化為毛囊細(xì)胞的體系。2.成功構(gòu)建陜北白絨山羊毛囊干細(xì)胞與毛乳頭細(xì)胞共培養(yǎng)組和對照組樣品的6個(gè)m RNA文庫和6個(gè)Small RNA文庫。轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)兩組樣品中共表達(dá)的基因有12802個(gè),差異表達(dá)的基因有656個(gè),其中上調(diào)基因有342個(gè),下調(diào)基因有314個(gè);靶基因GO和KEGG富集分析結(jié)果表明,這些差異表達(dá)的基因與TNF、p53、Apoptosis等信號通路相關(guān)。mi RNA測序分析發(fā)現(xiàn)兩組樣品間差異表達(dá)的mi RNA有13個(gè),其中上調(diào)mi RNA有6個(gè),下調(diào)mi RNA有7個(gè);篩選出4個(gè)關(guān)鍵候選mi RNA,分別為mi R-1、mi R-151-3p、mi R-182、mi R-143-3p;靶基因GO和KEGG富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),靶基因與RNA transport、Legionellosis通路相關(guān)。m RNA與mi RNA聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在TNF、Fox O和Amphetamine addiction三個(gè)通路,與細(xì)胞增殖,凋亡和代謝有關(guān)。3.利用梯度離心和超速離心,從陜北白絨山羊毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)基中成功分離出細(xì)胞外囊泡,通過外泌體標(biāo)志性蛋白、粒徑大小和透射電鏡觀察等證明,分離得到的細(xì)胞外囊泡為外泌體。在體外通過Transwell小室將毛囊干細(xì)胞與Di I標(biāo)記的毛乳頭細(xì)胞共培養(yǎng),以及用Di I標(biāo)記的外泌體孵育毛囊干細(xì)胞,證明毛乳頭細(xì)胞來源外泌體可以運(yùn)輸?shù)矫腋杉?xì)胞,且毛囊干細(xì)胞能夠攝取毛乳頭細(xì)胞來源外泌體。4.成功構(gòu)建毛乳頭細(xì)胞及其外泌體的6個(gè)Small RNA文庫。測序分析發(fā)現(xiàn)271個(gè)已知的mi RNA,其中187個(gè)mi RNA共表達(dá),79個(gè)mi RNA在毛乳頭細(xì)胞特異表達(dá),5個(gè)mi RNA在毛乳頭細(xì)胞來源外泌體特異表達(dá);在毛乳頭細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞來源外泌體差異表達(dá)的mi RNA有111個(gè),在毛乳頭細(xì)胞來源外泌體49個(gè)mi RNA上調(diào),62個(gè)mi RNA下調(diào);在外泌體上調(diào)的49個(gè)mi RNA中,mi R-21-5p、mi R-143-3p、let-7i-5p、mi R-148a-3p、let-7b-5p表達(dá)量位于前五。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)336個(gè)新mi RNA,其中141個(gè)mi RNA在毛乳頭細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞來源外泌體中差異表達(dá)。5.毛乳頭細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞來源外泌體差異表達(dá)的mi RNA預(yù)測得到33055個(gè)靶基因;GO富集分析結(jié)果表明,靶基因主要富集在細(xì)胞組分的胞外區(qū)域等功能子集,分子功能的結(jié)合和催化活性等功能子集以及生物過程的大分子修飾等功能子集;KEGG生物學(xué)通路注釋發(fā)現(xiàn),靶基因注釋到271個(gè)通路中,主要參與了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞吞作用、蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)節(jié)、脂質(zhì)和脂肪酸代謝。6.成功構(gòu)建了mi R-22-5p候選靶基因IGF1R,SOX9,MSI2,FOXC1,FOXP1和LEF1的雙熒光素酶報(bào)告載體;雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測結(jié)果表明,LEF1是mi R-22-5p的靶基因,mi R-22-5p能夠靶向調(diào)節(jié)預(yù)測的LEF1的靶位點(diǎn);在毛囊干細(xì)胞中過表達(dá)mi R-22-5p發(fā)現(xiàn),mi R-22-5p經(jīng)由AKT信號通路抑制毛囊干細(xì)胞的增殖,但對毛囊干細(xì)胞向毛囊細(xì)胞分化無顯著影響。7.成功構(gòu)建了let-7b-5p候選靶基因KDM6A,FOXC1和MSI2的雙熒光素酶報(bào)告載體;雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測結(jié)果表明,FOXC1和MSI2是let-7b-5p的靶基因,let-7b-5p能夠靶向調(diào)節(jié)預(yù)測的FOXC1和MSI2的靶位點(diǎn);在毛囊干細(xì)胞中過表達(dá)let-7b-5p,發(fā)現(xiàn)let-7b-5p經(jīng)由AKT信號通路抑制毛囊干細(xì)胞的增殖,并通過激活Notch信號通路從而促進(jìn)毛囊干細(xì)胞向毛囊細(xì)胞分化。綜上所述,本研究成功分離得到陜北白絨山毛囊干細(xì)胞及毛乳頭細(xì)胞來源外泌體。通過對毛囊干細(xì)胞與毛乳頭細(xì)胞共培養(yǎng)組和對照組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和mi RNA測序,以及毛乳頭細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞來源外泌體的mi RNA測序,利用生物學(xué)信息分析篩選出影響毛囊干細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵基因和mi RNA,并驗(yàn)證毛乳頭細(xì)胞來源外泌體的mi R-22-5p和let-7b-5p對毛囊干細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用,為進(jìn)一步闡明調(diào)控毛囊干細(xì)胞增殖分化及毛囊周期循環(huán)的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 毛囊的解剖結(jié)構(gòu)(Alonso and Fuchs, 2006)Figure 1-1 Anatomy of Hair Folliclehair root）（皮膚以內(nèi)的毛發(fā)部分）由內(nèi)根鞘（inner root sheath， root sheath，ORS）包圍和固定。IRS 由外向內(nèi)由三層組成：Cuticlee 層(Montagna et al., 1958)。IRS 從毛母質(zhì)延伸至皮脂腺導(dǎo)管開口S 逐漸消失，只留下毛干的鞘小皮（Cuticle）層和 cortex 層暴露 Cuticle 與毛干的 Cuticle 結(jié)構(gòu)相同，互相借助鋸齒狀突起緊密連著，決定毛干的形狀。ORS 與 IRS 的 Henle 層相鄰并深入真皮 IRS，，在 DP 毛球區(qū)域處 ORS 逐漸消失。ORS 向外延伸的區(qū)域所組成的皮脂腺（sebaceous gland），這些細(xì)胞體積很大，細(xì)胞泡，并通過皮脂腺導(dǎo)管連接在一起。表皮細(xì)胞分為干細(xì)胞、短暫增殖細(xì)胞（transit amplifying cells，化細(xì)胞（postmitotic differentiating cells，PDC）三種。在立毛肌附突”（Bulge）是毛囊干細(xì)胞存在的位置。Cotsarelis 等（1990）

圖 1-2 毛囊周期性變化(Alonso and Fuchs, 2006)Figure 1-2 The hair cycle囊再生的機(jī)理尚不清楚，但普遍接受的理論是“隆突激活學(xué)說 DP 緊鄰 HFSCs，HFSCs 接受來自 DP 的激活信號而被啟動長期。Greco V 等（2009）提出“兩步激活假說”，存于 Bulge細(xì)胞（Bulge SCs，BuSCs），次級毛芽中的干細(xì)胞稱為毛芽HGSCs），他們都具有干細(xì)胞的普遍特性，但是這兩類細(xì)胞進(jìn)。HGSCs 最先被激活，而 BuSCs 相對靜止，活化時(shí)間比較晚ulge，BuSCs 才被誘導(dǎo)分化形成生長期毛囊的 ORS，而且部分在下一輪毛發(fā)再生過程中形成毛芽（圖 1-3）(Greco et al., 20hieh et al., 2014)。HGSCs 爆發(fā)式的增殖標(biāo)志著生長期的開始。P 靠近次級毛芽。DPCs 分泌信號促進(jìn) HGSCs 的增殖分化形成 祖細(xì)胞，無論哪種機(jī)理，HFSCs 和 DPCs 之間都相當(dāng)頻繁地
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S827


本文編號：2644278