【摘要】：豬瘟和口蹄疫分別感染豬和偶蹄動(dòng)物,傳播范圍廣,危害大,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前主要采用病毒弱毒苗和滅活苗防控,但是兩者都有一定的缺陷,所以研發(fā)一種抗豬瘟和口蹄疫病毒的基因工程亞單位疫苗十分必要。研究發(fā)現(xiàn),豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E0、E2和口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白中的VP1蛋白能夠誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)病毒的中和抗體。因此,本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù),制備豬瘟和口蹄疫病毒重要結(jié)構(gòu)蛋白奶山羊乳腺生物反應(yīng)器。構(gòu)建了豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E0、E2和口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP1蛋白)外源基因的慢病毒表達(dá)載體,包裝病毒顆粒,轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞驗(yàn)證豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E0、E2和口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP1蛋白)在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá);用慢病毒感染胚胎,制備轉(zhuǎn)基因羊,獲得如下結(jié)果:1.利用PCR技術(shù)克隆了CSFV-E0、CSFV-E2、AFMDV-VP1、OFMDV-VP1目的基因,并在5’端加His-Flag標(biāo)簽;克隆兩個(gè)乳腺特異性的BLG啟動(dòng)子,分別為BLG5和BLG11;利用上述元件構(gòu)建出乳腺特異性的慢病毒載體PCDH-BP5/11-CSFV-E2、PCDH-BP5/11-CSFV-E0、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1、PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1雙酶切鑒定驗(yàn)證了載體構(gòu)建成功。2.將慢病毒包裝質(zhì)粒PMD2G、PSPAX和慢病毒載體質(zhì)粒PCDH-BP5/11-CSFV-E2、PCDH-BP5/11-CSFV-E0、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1、PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞,得到了帶有目的基因的慢病毒,感染乳腺上皮細(xì)胞,RT-PCR和Western blotting檢測(cè)到乳腺上皮細(xì)胞上清中有CSFV-E2、CSFV-E0、AFMDV-VP1和OFMDV-VP1的表達(dá)。3.利用超數(shù)排卵技術(shù),獲得山羊受精卵180枚,將病毒液注射到受精卵透明帶間隙,選擇存活的胚胎149枚,移植受體50只,獲得后代35只,經(jīng)PCR鑒定,獲得PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1轉(zhuǎn)基因羊4只,PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1轉(zhuǎn)基因羊6只,PCDH-BP5/11-CSFV-E0轉(zhuǎn)基因羊3只,PCDH-BP5/11-CSFV-E2轉(zhuǎn)基因羊3只。
【圖文】：

恒溫?fù)u床 上海�，攲�(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司 China2.1.3 載體和菌株如圖2-1所示慢病毒骨架載體PCDH-CMV-EF1-copGFP，質(zhì)粒PMD-18T構(gòu)自TaKaRa公司，E.coli Trans5α 感受態(tài)細(xì)菌，慢病毒包裝質(zhì)粒 PMD2G、PSPAX 本實(shí)驗(yàn)室保存有，293T 細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室保存。9

用Cla I和Sal I酶切PCDH-BP5/11-CSFV-E0、PCDH-BP5/11-CSFV-E2、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到基因條帶（圖2-5），載體酶切結(jié)果與預(yù)期一致。切膠回收，送測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果，序列一致表明重組慢病毒穿梭載體構(gòu)建成功。19
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2643274