【摘要】：應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)應(yīng)激激素大量分泌,其中以皮質(zhì)醇為主,它是影響肉質(zhì)的一個(gè)較為重要的因素。課題組前期研究表明,在動(dòng)物日糧飼喂過(guò)程中添加皮質(zhì)醇會(huì)導(dǎo)致仔豬背最長(zhǎng)肌肌肉組織受損嚴(yán)重,肌纖維間隙增大,凋亡細(xì)胞數(shù)增多。但目前關(guān)于應(yīng)激激素是如何影響肉質(zhì)以及通過(guò)何種方式導(dǎo)致肉質(zhì)發(fā)生變化的機(jī)制并不完全清楚�，F(xiàn)今研究表明糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)主要通過(guò)細(xì)胞膜與體內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體α(glucocorticoid receptor alpha,GRα)結(jié)合發(fā)揮一系列調(diào)控作用。在這些基礎(chǔ)上,本課題以GRα為主要研究對(duì)象,探究GRα對(duì)豬原代骨骼肌細(xì)胞(pig skeletal muscle cells,PSC)生長(zhǎng)的影響以及在豬劣質(zhì)肉產(chǎn)生過(guò)程中的作用,并探究相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制。本課題主要研究結(jié)果如下:1.地塞米松引起豬肌細(xì)胞氧化應(yīng)激地塞米松(dexamethasone,DEX)處理PSC細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其對(duì)肌細(xì)胞有明顯的毒性,且與對(duì)照組相比DEX組細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基大量上升,造成細(xì)胞氧化應(yīng)激;等濃度米非司酮(mifepristone,RU486)處理后細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)明顯下降。通過(guò)MTT法檢測(cè)DEX對(duì)PSC細(xì)胞增殖的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:DEX抑制PSC細(xì)胞增殖。通過(guò)qPCR和Western blot檢測(cè)DEX對(duì)細(xì)胞應(yīng)激的影響,結(jié)果表明:DEX能促進(jìn)PSC細(xì)胞中HSP90的表達(dá);等濃度RU486處理后能抑制PSC細(xì)胞中HSP90的表達(dá)。2.GRα對(duì)PSC細(xì)胞功能的影響通過(guò)構(gòu)建GRα超表達(dá)載體和合成siRNA來(lái)超表達(dá)和抑制GRα的表達(dá)。通過(guò)流式細(xì)胞儀和MTT法檢測(cè)GRα對(duì)PSC細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果表明:超表達(dá)GRα可以促進(jìn)PSC細(xì)胞凋亡,抑制PSC細(xì)胞增殖。且通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的氧自由基發(fā)現(xiàn)其含量顯著升高,說(shuō)明細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。通過(guò)qPCR檢測(cè)GRα對(duì)細(xì)胞應(yīng)激與凋亡調(diào)控相關(guān)基因的影響,結(jié)果表明:超表達(dá)GRα能促進(jìn)PSC細(xì)胞中BAX、HSP90、CAST和GPX2的表達(dá);同樣,干擾GRα能抑制HSP90、CAST和GPX2的表達(dá)。超表達(dá)GRα和干擾GRα后檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:超表達(dá)GRα后谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性顯著升高,干擾GRα后谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性降低�？赡苁菣C(jī)體應(yīng)激水平過(guò)高,并通過(guò)提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性以維持機(jī)體穩(wěn)定。3.GRα靶基因的篩選干擾GRα后根據(jù)表達(dá)差異篩選GRα的靶基因,定量結(jié)果顯示,干擾GRα后極顯著下調(diào)Tβ10的表達(dá),下調(diào)HSP90和HSP27的表達(dá);且超表達(dá)GRα后Tβ10的表達(dá)顯著升高,上調(diào)HSP90和HSP27的表達(dá),且在網(wǎng)站上預(yù)測(cè)出GRα與Tβ10的結(jié)合位點(diǎn)。因此推測(cè)Tβ10可能是GRα的靶基因,雙熒光素酶報(bào)告和染色質(zhì)免疫共沉淀等試驗(yàn)初步驗(yàn)證,結(jié)果表明Tβ10可能是GRα潛在的靶基因。構(gòu)建Tβ10超表達(dá)載體后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Tβ10對(duì)PSC細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果表明:超表達(dá)Tβ10可以促進(jìn)PSC細(xì)胞凋亡。且通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的氧自由基發(fā)現(xiàn)其含量顯著升高,說(shuō)明細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。通過(guò)qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Tβ10對(duì)細(xì)胞應(yīng)激與凋亡調(diào)控相關(guān)基因的影響,結(jié)果表明:超表達(dá)Tβ10能促進(jìn)PSC細(xì)胞中BAX、HSP90、HSP27和CAST的表達(dá)。4.APS通過(guò)抑制GRα的表達(dá)緩解機(jī)體應(yīng)激與GRα組相比添加不同濃度的(0.1 mg/mL,1 mg/mL,10 mg/mL和100 mg/mL)黃芪多糖(astragalus Polysacharin,APS)后可緩解細(xì)胞應(yīng)激,并通過(guò)檢測(cè)ROS含量找出最適濃度為10 mg/mL。添加10 mg/mL APS后機(jī)體的ROS水平顯著降低,且與對(duì)照組趨于一致。通過(guò)MTT法檢測(cè)APS對(duì)PSC細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果表明:APS可顯著緩解超表達(dá)GRα后抑制PSC細(xì)胞增殖的作用。且添加APS后與GRα組相比谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活顯著降低,從而維持機(jī)體穩(wěn)定。通過(guò)QPCR和Western blot檢測(cè)APS對(duì)PSC細(xì)胞應(yīng)激與凋亡調(diào)控相關(guān)基因的影響,結(jié)果顯示:與GRα組相比添加APS可抑制PSC細(xì)胞中BAX、HSP90、CAST和Tβ10的表達(dá)。表明APS通過(guò)抑制GRα的表達(dá)緩解機(jī)體應(yīng)激。
【圖文】：

GRα 調(diào)控 Tβ10 致豬骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的研究有細(xì)胞都是它的靶細(xì)胞。如圖 1-1 所示，糖皮質(zhì)激素穿過(guò)細(xì)胞SP90 復(fù)合物結(jié)合。在配體結(jié)合后，HSP90 被釋放，并且 GR 轉(zhuǎn)移至細(xì)核中它可以結(jié)合 DNA 并與共激活劑(CoA)和轉(zhuǎn)錄起始結(jié)構(gòu)相互作用以。GR 還可以通過(guò)與 DNA 結(jié)合或通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用抑制基因GR 也可以通過(guò)激活激酶途徑與細(xì)胞膜結(jié)合快速引起信號(hào)傳導(dǎo)(Garabed。

皮質(zhì)激素通過(guò)細(xì)胞凋亡影響肉質(zhì)圖 1-2 所示，細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程不僅受外部信號(hào)控制，而且序的調(diào)控，研究表明 EADs 誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激且凋亡因子表達(dá)水平發(fā)致細(xì)胞凋亡(Yin et al 2015)。研究表明糖皮質(zhì)激素以組織特異性方式控存活，且糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和 T 淋巴細(xì)胞發(fā)rdam et al 2002)。較多文獻(xiàn)報(bào)道糖皮質(zhì)激素是通過(guò)調(diào)節(jié)一些基因包括和NF-κB來(lái)發(fā)揮細(xì)胞凋亡作用的(Lotem et al 1995, Pecci et al 1997, H)。應(yīng)激導(dǎo)致皮質(zhì)醇升高將活化的 GRα 移位進(jìn)入核中，與 IP3R1 基因調(diào) IP3R1 的表達(dá)引起細(xì)胞凋亡，受損的肌細(xì)胞導(dǎo)致了肉質(zhì)的變化(C因此機(jī)體應(yīng)激導(dǎo)致體內(nèi)糖皮質(zhì)激素水平的變化，，從而上調(diào)或下調(diào)一些起肉質(zhì)損傷。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S828

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2641928