【摘要】：豬鏈球菌2型(Streptococcus suis Type 2,SS2)是一種重要的人豬共患病原,感染仔豬可誘發(fā)腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎和敗血癥等癥狀,其中尤以腦膜炎最為嚴(yán)重,每年不僅對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,也嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生安全。烯醇化酶(Enolase,Eno)是糖酵解過程的關(guān)鍵催化酶,可催化2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸。近些年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)原核生物Eno除了具有催化功能外,還在某些病原微生物感染的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。本課題組前期通過SS2基因組隨機(jī)展示文庫與豬腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PBMEC)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(AC)共培養(yǎng)模型互作篩選到的SS2 Eno是重要的互作分子,但尚未有關(guān)于Eno在SS2突破血腦屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)誘發(fā)腦膜炎中作用的相關(guān)報道,為此,本研究針對Eno在SS2腦膜炎發(fā)生中的作用及機(jī)制開展了以下工作:1.為闡明SS2 Eno在SS2感染機(jī)體入侵BBB中的作用,原核表達(dá)獲得了重組蛋白Eno,建立共培養(yǎng)BBB模型,將重組Eno作用于BBB模型,模型跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(TEER)的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)Eno可顯著增加BBB模型通透性,抗體阻斷Eno也可顯著抑制SS2對PBMEC的粘附、入侵以及對BBB的破壞作用;ICR小鼠靜脈注射Eno抗體以封閉SS2感染小鼠時Eno的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗體阻斷Eno可顯著提升SS2感染ICR小鼠存活率;此外,抗體阻斷Eno可顯著抑制SS2感染小鼠腦部對EB的通透性。以上結(jié)果說明了Eno介導(dǎo)了SS2感染機(jī)體和對BBB的破壞。2.為探討Eno破壞BBB的作用機(jī)制,本研究通過Annexin-V/PI雙染法、Western blot(WB)等方法分析Eno刺激PBMEC的凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):Eno可通過Caspase-8/Caspase3途徑誘導(dǎo)PBMEC發(fā)生凋亡,抗體阻斷Eno可顯著抑制SS2誘導(dǎo)的PBMEC凋亡,說明Eno在SS2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中占有重要作用;為探討凋亡在SS2入侵BBB中的作用,使用凋亡抑制劑抑制BBB模型上室PBMEC凋亡的發(fā)生,結(jié)果顯示抑制凋亡可顯著抑制SS2對BBB模型的穿越;除檢測凋亡外,研究通過RT-PCR、WB和免疫熒光等方法檢測了Eno作用于PBMEC后其細(xì)胞間緊密連接蛋白(Tight junction proteins,TJs)的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Eno可顯著抑制細(xì)胞間TJs ZO-1和Occludin的表達(dá);利用穩(wěn)定表達(dá)Eno的BL21菌株(BL21-Eno)感染小鼠,并對小鼠腦部TJs的表達(dá)進(jìn)行WB分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BL21-Eno感染小鼠腦部ZO-1和Occludin表達(dá)量顯著低于BL21-23a(轉(zhuǎn)化p ET23a空載體的BL21)感染組。以上結(jié)果說明了Eno可通過誘導(dǎo)PBMEC凋亡和抑制細(xì)胞間ZO-1和Occludin的表達(dá)進(jìn)而增加BBB的通透性。3.為找到Eno在PBMEC表面的受體,本研究通過Pull down、質(zhì)譜分析、免疫共沉淀(Co-ip)等實驗,最終發(fā)現(xiàn)RPSA是Eno在細(xì)胞表面的互作蛋白,免疫熒光分析結(jié)果也顯示Eno與RPSA可共定位于細(xì)胞表面。4.為探討RPSA和HSPD1在Eno誘導(dǎo)的PBMEC凋亡和抑制TJs表達(dá)中的作用,研究首先對Eno、RPSA、HSPD1三者的關(guān)系進(jìn)行分析,WB結(jié)果顯示Eno刺激細(xì)胞后RPSA和HSPD1高表達(dá),敲低或敲除RPSA可顯著抑制Eno誘導(dǎo)HSPD1高表達(dá),而敲低HSPD1卻對Eno誘導(dǎo)的RPSA表達(dá)無影響,表明Eno與RPSA結(jié)合誘導(dǎo)了HSPD1的高表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)敲低(或敲除)RPSA和HSPD1可顯著抑制Eno誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;WB分析發(fā)現(xiàn)敲低或敲除RPSA可以使得Eno抑制TJs的表達(dá)得到一定程度的恢復(fù),但是敲低HSPD1對TJs的表達(dá)抑制無影響。為進(jìn)一步確定Eno與RPSA結(jié)合誘導(dǎo)HSPD1高表達(dá)的機(jī)制,本研究對Eno刺激后胞漿蛋白和核蛋白分別進(jìn)行磷酸化蛋白組學(xué)和核蛋白組學(xué)分析,并通過WB進(jìn)行驗證分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Eno與RPSA結(jié)合后胞漿p38和ERK被顯著激活,進(jìn)而激活下游核轉(zhuǎn)錄因子e IF4E,最終導(dǎo)致HSPD1高表達(dá)。5.為了在體內(nèi)驗證以上相關(guān)信號分子的表達(dá),本研究通過攜帶sh RPSA和sh HSPD1的AAV9感染小鼠腦部,建立腦部敲降RPSA和或HSPD1模型,并對Eno注射或SS2感染后小鼠腦部各類樣本進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因敲降RPSA和HSPD1顯著提升了SS2感染小鼠的存活率,致弱了SS2對腦部的破壞作用;免疫組化分析Eno刺激細(xì)胞活化的相關(guān)分子(RPSA、HSPD1、p38、ERK、e IF4E、Caspase-3、ZO-1、Occludin等)的表達(dá)情況,結(jié)果與體外研究結(jié)果相一致;建立SS2感染巴馬香豬的腦膜炎與非腦膜炎模型,并對以上信號分子在腦膜炎感染豬腦部的表達(dá)情況做了免疫組化分析,結(jié)果與體外研究結(jié)果一致。綜上,本研究發(fā)現(xiàn)Eno通過與細(xì)胞表面RPSA結(jié)合,激活下游p38/ERK-e IF4E信號,進(jìn)而導(dǎo)致HSPD1表達(dá)和胞外分泌增加,最終引起細(xì)胞凋亡;Eno與RPSA結(jié)合可激活胞內(nèi)Rho A信號,進(jìn)而抑制ZO-1和Occludin的表達(dá),導(dǎo)致BBB通透性增加。以上現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及機(jī)制的闡明為SS2突破BBB機(jī)制的研究提供重要的理論基礎(chǔ),也為腦膜炎防治提供了借鑒。
【圖文】：

要病原及豬鏈球菌 2 型腦膜炎的危害炎是世界上十大由于感染導(dǎo)致死亡的疾病之一，菌性病原隨血液流動擴(kuò)散入腦部引發(fā)的腦膜或成中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous system，CNS腦膜為三層膜結(jié)構(gòu)（Fig 1.1），起到連接大腦和（Blood-Brain Barrier，BBB）的存在，即使細(xì)菌，但是除了很少一部分細(xì)菌外，，血液中大量的細(xì)，機(jī)體就是憑借該屏障來保護(hù)腦部組織免受損害源于血液的病原菌可以利用自身的某些獨特機(jī)制感染，這類由病原菌造成的 CNS 感染常被稱為細(xì) BBB 的機(jī)制成為當(dāng)前細(xì)菌性腦膜炎相關(guān)研究的

圖 1.2 豬鏈球菌 2 型流行情況（引自 Huong et al., 2014）Fig 1.2 Epidemiology of Streptococcus suis Type 2近年來，細(xì)菌穿越 BBB 進(jìn)入 CNS 造成腦部感染的機(jī)制得到了廣泛的研究，其之所以得到全世界學(xué)者的廣泛關(guān)注的根本原因在于細(xì)菌可以通過其獨有的機(jī)制通過 BBB 造成 CNS 感染，而治療感染的抗菌藥物無法通過屏障到達(dá)治療靶部位[18]，這才是細(xì)菌性腦膜炎防治困難的關(guān)鍵所在。因而，闡明細(xì)菌突破 BBB 入侵 CNS 的機(jī)制對該病發(fā)病機(jī)制的研究和治療藥物的研制提供重要的理論基礎(chǔ)，對腦膜炎的防治意義重大。2 病原菌突破血腦屏障的機(jī)制細(xì)菌性腦膜炎的發(fā)生過程大致分為以下四個步驟：（1）細(xì)菌在上皮粘膜定植，某種細(xì)菌的定植受其他細(xì)菌或病毒的影響，某種細(xì)菌對其他細(xì)菌的定植可產(chǎn)生協(xié)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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1 揭瑞;董佳慧;韓冬;王瑞玲;韓魏巍;杜戎;耿輝;;人源α-烯醇化酶B細(xì)胞表位鑒定及其與牙齦卟啉單胞菌烯醇化酶的交叉反應(yīng)預(yù)測[J];中國免疫學(xué)雜志;2015年01期

本文編號：2640194