【摘要】：沙門菌病(Salmonellosis)是重要的人獸共患病,是沙門菌(Salmonella)感染引起的人類和動物疾病的總稱。該病的主要癥狀有惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)燒和頭痛等,另有研究顯示,沙門菌感染還會導致尿路感染、敗血癥、紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、感染性心內(nèi)膜炎發(fā)生。腸炎沙門菌(Salmonella entericaserovar Enteritidis,Salmonella Enteritidis)屬于宿主泛嗜性的沙門菌血清型,近年來,該菌已逐漸成為導致人沙門菌病的最主要的血清型之一。腸炎沙門菌不僅會給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失,對人類健康所產(chǎn)生的公共衛(wèi)生安全負擔更是無法精確估測,可見腸炎沙門菌感染和污染的防控是一項亟待解決的重要的食品安全問題。然而關于腸炎沙門菌致病機制和防控基礎研究的空白點仍然很多,亟待加強和深入。腸炎沙門菌外膜具有保護性功能,有利于菌株的逆境生存與體內(nèi)入侵。作為菌體外膜結(jié)構的重要組分,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)主要影響沙門菌的光滑粗糙表型、毒力、鞭毛組裝以及菌株間的免疫交叉反應。LPS主要由O抗原、核心多糖以及類脂A組成,其中O抗原鏈的完整性決定著菌株的光滑粗糙表型。因此,LPS合成相關基因的失活可能造成腸炎沙門菌從光滑表型向粗糙表型的轉(zhuǎn)變,但相關基因及其作用機制有待進一步研究。腸炎沙門菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system,T3SS)將一系列效應蛋白注入宿主細胞。這些效應蛋白具有多種生物學活性,可以干擾宿主細胞正常功能。其中的效應蛋白AvrA被證實擁有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性,且能抑制宿主JNK和NF-κ B信號通路。通過這些方式,AvrA蛋白可以抑制宿主免疫反應,穩(wěn)定腸道細胞間緊密連接結(jié)構,從而利于沙門菌的體內(nèi)生存和繁殖,但其分子機制仍有待深入揭示。通過分子層面來分析病原菌致病的過程是理解病原菌分子致病機制常用而前景無限的方法,本研究應用信號標簽誘變技術(Signature-tagged mutagenesis,STM)構建了腸炎沙門菌轉(zhuǎn)座突變菌株庫,使用針對沙門菌O:9抗原的單克隆抗體(O:9單抗)成功篩選到與腸炎沙門菌粗糙型變異相關的基因,并對篩選到的候選基因rfbG、rfbH的生物學功能和可鑒別疫苗(DIVA疫苗)應用可行性進行了初步探究。另一方面,本研究利用腸炎沙門菌avrA基因缺失株、avrA基因回復株以及野生株,感染細胞系、類器官(organoids)、小鼠模型,分析自噬及其相關信號通路的變化規(guī)律,揭示了效應蛋白AvrA在調(diào)節(jié)腸上皮細胞自噬反應過程中的生理學影響與分子機制。以期為深入理解腸炎沙門菌的分子致病機制提供新的認識。1.腸炎沙門菌粗糙型變異相關基因的篩選與鑒定本研究利用STM技術構建了腸炎沙門菌轉(zhuǎn)座突變菌株庫,同時建立了利用O:9單抗初篩和吖啶橙復篩的腸炎沙門菌粗糙型變異菌株的玻板凝集篩選方法。初篩結(jié)果顯示有3株突變株不與O:9單抗發(fā)生凝集,進一步復篩發(fā)現(xiàn)其中兩株突變株與吖啶橙溶液凝集反應強烈,另一株突變株的凝集反應則較弱。后續(xù)使用“接頭法”定位插入失活基因的結(jié)果表明,與吖啶橙溶液凝集反應強烈的兩株突變株的插入失活基因分別為rfbG、rfbH,兩者均來自rfb基因簇,且位置相鄰,分別負責編碼一種與O抗原合成相關的脫水酶;而與吖啶橙溶液凝集反應較弱的突變株失活基因為rfc,是獨立于rfa和rfb基因簇外的,編碼“O抗原聚合酶”的基因。后續(xù)選取rfbG、rfbH基因,對其可能對沙門菌基本生物學特性的影響進行了研究:(1)突變株生化特性鑒定試驗和體外生長速率測定試驗表明,rfbG、rfbH基因的缺失對沙門菌生化特性和體外生長曲線無影響。(2)凝集試驗、LPS銀染試驗和自凝集試驗的結(jié)果表明rfbG、rfbH缺失株具有典型的粗糙型菌株特性。具體而言,即rfbG或rfbH基因的缺失不僅影響腸炎沙門菌與O:9單抗和吖啶橙的凝集反應;還會使腸炎沙門菌在靜置培養(yǎng)過程中形成沉淀;并導致腸炎沙門菌LPS中O抗原鏈的缺失,以及核心多糖結(jié)構的部分缺失與改變。(3)運動性試驗結(jié)果表明,rfbG、rfbH基因的缺失會大幅削弱腸炎沙門菌的泳動能力和群集游動能力。(4)突變株抗逆性試驗顯示,野生株與rfbG、rfbH缺失株均對酒精和高溫處理高度敏感,但rfbG、rfbH基因的缺失會增加腸炎沙門菌對氧化劑、堿性物質(zhì)以及消毒劑益歐迪(癸甲溴銨碘復合溶液)的敏感性。本研究揭示了rfbG、rfbH基因之于腸炎沙門菌生存能力的重要性,拓展了對rfbG、rfbH基因,乃至rfb基因簇影響腸炎沙門菌LPS生物合成和鞭毛組裝的認知。并為下一步rfbG、rfbH基因做為腸炎沙門菌DIVA疫苗位點的可行性研究提供了生物學材料。2.腸炎沙門菌粗糙型變異株作為DIVA疫苗的初步評價DIVA疫苗和傳統(tǒng)疫苗的主要區(qū)別是免疫動物產(chǎn)生的抗體能夠被區(qū)分,即利用配套的鑒別診斷方法(如血清凝集試驗或ELISA檢測),便可快速甄別免疫動物與天然感染動物。本研究對腸炎沙門菌粗糙型突變株(rfbG、rfbH基因缺失株)進行了可鑒別疫苗(DIVA)特性測試、小鼠安全性評價試驗、小鼠免疫保護性試驗、雛雞免疫保護性試驗等疫苗學試驗探究。血清凝集試驗顯示,免疫接種rfbG、rfbH基因缺失株的雞血清與陰性對照組的血清都不與野生型腸炎沙門菌C50041菌苔發(fā)生凝集反應,且使用沙門菌ELISA檢測試劑盒(flocktype(?)SalmonellaAbELISAkit)也全都檢測為沙門菌O抗原抗體陰性;相對的,野生株組或spic基因缺失株組的雞血清使用兩種方式則全部檢測為沙門菌O抗原抗體陽性。此外,免疫rfbG缺失株的小鼠血清同樣不與野生株菌苔發(fā)生凝集反應。綜上可見,rfbG、rfbH缺失株不會刺激機體產(chǎn)生針對O抗原的特異性抗體,因而不會被基于沙門菌O抗原抗體檢測設計的診斷方法判定為沙門菌陽性。因此,rfbG、rfbH基因位點具有作為腸炎沙門菌DIVA疫苗靶點的潛力。小鼠安全性評價試驗和小鼠免疫保護性試驗結(jié)果顯示,rfbG基因單缺失株對小鼠安全、可靠,并能為免疫小鼠提供較為優(yōu)良的免疫保護效力,結(jié)合上一章研究中突變株抗逆性試驗結(jié)果則表明,rfbG基因單缺失株是對哺乳動物安全、且對環(huán)境友好的理想疫苗候選株。SPF雞保護性試驗表明,免疫突變株C50041△spiC-rfbG::Tn5Km2(Cm)可以抑制腸炎沙門菌野生株C50041在SPF雞肝臟內(nèi)定殖,可見spiC、rfbG基因雙突變株作為腸炎沙門菌DIVA疫苗候選株頗具應用前景。本研究不僅發(fā)現(xiàn)了新的DIVA疫苗靶點(基因rfbG、rfbH),還證實研究中建立的基于STM技術利用單抗凝集試驗的粗糙型菌株篩選方法,不僅可用于探究病原菌LPS生物合成機制,還可拓展應用于DIVA疫苗靶點的高通量甄選,為疫苗靶點篩選的研究拓寬了思路。3.腸炎沙門菌效應蛋白AvrA通過靶向Beclin-1蛋白抑制宿主自噬反應本研究使用實驗室前期工作中構建的腸炎沙門菌avrA基因缺失株、avrA基因回復株以及野生株,感染HCT116細胞系、類器官(organoids)、C57BL/6小鼠,揭示了效應蛋白AvrA對腸上皮細胞自噬反應的影響以及其中的分子機制。經(jīng)腸炎沙門菌avrA缺失株感染的HCT116細胞,其LC3 Ⅰ蛋白向LC3 Ⅱ蛋白轉(zhuǎn)變的比率顯著高于經(jīng)野生株或回復株感染的HCT116細胞。同時,在avrA缺失株感染的細胞中,p62蛋白的表達量較之野生株與回復株感染組明顯降低。此外,經(jīng)LysoTracker試劑預處理的HCT116細胞,感染avrA缺失株后展現(xiàn)出的溶酶體染色數(shù)量,較之野生株或回復株感染組大幅上升。說明在體外培養(yǎng)的細胞模型中腸炎沙門菌效應蛋白AvrA可以抑制細胞的自噬反應。后續(xù)WB試驗結(jié)果顯示,經(jīng)野生株或avrA回復株感染的腸上皮細胞(HCT116細胞系、organoids細胞、小鼠回腸上皮細胞),其Beclin-1蛋白表達水平,較之a(chǎn)vrA缺失株感染組顯著下降。而經(jīng)JNK抑制劑處理的HCT116細胞,其Beclin-1蛋白的表達水平在野生株、avrA缺失株、avrA回復株感染組之間無差異。這一發(fā)現(xiàn)表明,腸炎沙門菌效應蛋白AvrA是通過抑制JNK信號通路,進而降低Beclin-1蛋白表達。而質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試驗表明,C186A位點的突變可以廢除AvrA蛋白對JNK信號通路的影響,以及對Beclin-1蛋白表達量的調(diào)控作用。免疫共沉淀試驗的結(jié)果證實,AvrA蛋白可與Beclin-1蛋白發(fā)生互作。此外,質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染試驗還觀察到,AvrA蛋白可以下調(diào)Beclin-1蛋白泛素化的水平,C186A點突變的AvrA蛋白則失去了去泛素化酶活性。經(jīng)腸炎沙門菌感染的小鼠的回腸樣品的溶菌酶素染色結(jié)果顯示,野生株感染的小鼠,其正常Paneth細胞數(shù)量,較之a(chǎn)vrA缺失株感染組大幅下降。即野生株感染組的Paneth細胞中的分泌顆粒更多呈現(xiàn)損耗(disorganized)、殆盡(diminished)或罄盡(diffuse)的狀態(tài)。綜上所述,腸炎沙門菌效應蛋白AvrA在與宿主腸上皮細胞相互作用過程中,通過抑制JNK信號通路,降低宿主Beclin-1蛋白的表達。由此,腸炎沙門菌實現(xiàn)抑制宿主自噬反應,進而利于該菌的體內(nèi)生存。此外,AvrA蛋白對小鼠Paneth細胞分泌顆粒狀態(tài)的影響,也可能是通過抑制宿主自噬反應實現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)了一條腸炎沙門菌及其效應蛋白顛覆宿主細胞生物學過程的全新策略,擴展了我們對腸炎沙門菌致病機制的認知。
【圖文】：

ＳＴＭ技術是基于轉(zhuǎn)座隨機突變，用于對目標菌株功能基因進行表型篩選和平行分析的逡逑實驗方法［１（）］，這一過程既可通過正向篩選的形式，，亦可用負向篩選的方法找尋目標基因［１１］逡逑（圖１Ａ）。該方法是由Ｈｅｎｓｅｌ等于１９９５年在研究鼠傷寒沙門菌時建立，ＳＴＭ技術建立的逡逑早期目標旨在實現(xiàn)通過負向篩選的形式發(fā)現(xiàn)新的毒力相關基因［１２，１３］。其原理是，帶有不同逡逑標簽序列的轉(zhuǎn)座子隨機插入到病原菌的毒力基因序列中后，所產(chǎn)生的突變株會由于相關毒逡逑力基因的插入失活，而導致其無法在機體內(nèi)持續(xù)存活，因而能夠從一個混合的突變體庫感逡逑染過程中，識別出毒力減弱的突變株，繼而發(fā)現(xiàn)毒力相關基因［１４，１５］（圖１Ｂ）。這一負向篩逡逑選方式既減少了工作量，又節(jié)省了實驗動物，是開展毒力基因研究的有效工具。當然，ＳＴＭ逡逑技術不僅限用于毒力基因的篩選，各類選擇性壓力，如溫度、氧含量、滲透壓、酸堿條件、逡逑營養(yǎng)條件等，只要在這類選擇性壓力下某些突變體存在生長缺陷或不能存活，都可以應用逡逑ＳＴＭ技術進行篩選

胞內(nèi)病原菌既可被吞噬細胞吞噬也可被非吞噬細胞內(nèi)化。進入宿主細胞后，病原菌被逡逑局限在內(nèi)化液泡（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎｖａｃｕｏｌｅ）中，這一結(jié)構也被稱為吞唾體（ｐｈａｇｏｓｏｍｅ）。如逡逑圖１中所示，包裹有病原菌的吞唾體與溶酶體融合形成吞j溶酶體（ｐｈａｇｏｌｙｓｏｓｏｍｅ），在逡逑吞噬溶酶體內(nèi)，細胞通過酶與過氧化物的作用殺滅病原菌，這即是吞嗤作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）逡逑清除胞內(nèi)病原菌的經(jīng)典流程。值得注意的是，近期研宄發(fā)現(xiàn)了邋ＬＣ３蛋白相關的吞噬作用逡逑（ＬＣ３－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，邋ＬＡＰ），在這一生物學過程中，自嗤的標志物ＬＣ３蛋白被招逡逑募至吞噬體附近，介導隨后的吞噬體與溶酶體的融合過程，并最終消解胞內(nèi)病原菌［１６，１７］。逡逑這說明，自噬與ＬＣ３蛋白相關的吞噬作用之間存在著交叉部分。為了防止被吞噬作用清除，逡逑病原菌可通過修飾吞嗤體使其成為含病原菌液泡（ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋ｖａｃｕｏｌｅ），從而避免逡逑與溶酶體的融合（如結(jié)核分枝桿菌或破壞吞嗤體，從而逡逑逃入細胞質(zhì)內(nèi)（如鼠傷寒沙門菌Ｓ１．邋Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）邋［１８－２Ｑ］。異體自嗤（Ｘｅｎｏｐｈａｇｙ）則被宿主逡逑細胞用于對抗這些“狡猾的”病原菌
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61

【參考文獻】

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本文編號：2635992