【摘要】：本試驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)和肉雞養(yǎng)殖試驗(yàn)探討了維生素K對肉雞骨骼質(zhì)量的調(diào)控作用。1.雞胚成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定通過大量試驗(yàn)摸索,利用酶消化法改進(jìn)了雞胚成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法,通過一系列的鑒定,表明本試驗(yàn)所分離的成骨細(xì)胞具有較高堿性磷酸酶活性、能夠分泌I型膠原酶、形成鈣化結(jié)節(jié)的特性。2.VK_2對雞胚成骨細(xì)胞增殖能力和堿性磷酸酶活性的影響用不同水平的VK_2(0μM、10~(-1)μM、10~(-2)μM、10~(-3)μM、10~(-4)μM、10~(-5)μM)處理雞胚成骨細(xì)胞,用CCK8法測定各組細(xì)胞在450 nm處的吸光度來描述雞胚成骨細(xì)胞的增殖能力,并檢測其堿性磷酸酶活性。結(jié)果顯示:成骨細(xì)胞的活力隨VK_2濃度的增加先增加再降低,培養(yǎng)基中添加濃度為10~(-4)μM、10~(-3)μM、10~(-2)μM的VK_2可以顯著增加成骨細(xì)胞的活力(P0.05)。同時(shí),成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性隨VK_2濃度的增加先增加再降低,培養(yǎng)基中添加濃度為10~(-4)μM、10~(-3)μM的VK_2可以顯著增加成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性(P0.05)。3.VK_2對地塞米松引起雞胚成骨細(xì)胞損傷的緩解作用(1)研究不同濃度的地塞米松對成骨細(xì)胞活性的影響:用不同水平的地塞米松(100μM、80μM、60μM、40μM、20μM、0μM)處理細(xì)胞,用CCK8法測定細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示:地塞米松能降低成骨細(xì)胞的活力,且與濃度有關(guān)。成骨細(xì)胞的活力最低的地塞米松最低濃度為60μM(P0.05)。(2)研究VK_2對地塞米松引起雞胚成骨細(xì)胞損傷的緩解作用:用不同濃度的VK_2和地塞米松(0μM地塞米松+0μM VK_2、60μM地塞米松+0μM VK_2、60μM地塞米松+10~(-5)μM VK_2、60μM地塞米松+10~(-4)μM VK_2、60μM地塞米松+10~(-3)μM VK_2、60μM地塞米松+10~(-2)μM VK_2、60μM地塞米松+10~(-1)μM VK_2)處理細(xì)胞,CCK8法測細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示:用60μM的地塞米松與不同濃度的VK_2同時(shí)作用于成骨細(xì)胞,成骨細(xì)胞的活力隨著VK_2濃度的增加先增加再降低,當(dāng)VK_2濃度為10~(-4)μM時(shí),成骨細(xì)胞活力最高(P0.05)。4.體內(nèi)試驗(yàn)試驗(yàn)選用360只1日齡愛拔益加(AA~+)公雞(平均體重45±0.5g),按每個(gè)處理組平均體重基本一致原則隨機(jī)分成3個(gè)處理組:對照組、0.5 mg/kg VK_3組、4 mg/kg VK_3組。每組6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)20只雞。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧,其余兩組分別飼喂添加0.5 mg/kg(NRC推薦水平)和4 mg/kg VK_3的基礎(chǔ)日糧,基礎(chǔ)日糧中不額外添加維生素K;所有肉雞用不額外添加維生素K的日糧預(yù)飼3天后開始正式試驗(yàn),正式試驗(yàn)周期為42天。在正式試驗(yàn)的第21天和42天,每重復(fù)隨機(jī)選取3只體重相近的肉雞,翅下靜脈采血,屠宰取樣。結(jié)果顯示:4.1肉雞生長性能、腿病和血液生化指標(biāo)與不添加維生素K_3組相比,日糧中添加0.5 mg/kg和4 mg/kg維生素K_3顯著增加了肉雞平均日增重(21-42 d和1-42 d)(P0.05),降低料重比(1-21d、21-42 d和1-42 d)(P0.05),但對平均日采食量無影響;提高了21日齡肉雞血清鈣含量(P0.05);與不添加維生素K相比,日糧中添加0.5 mg/kg顯著提高了42日齡肉雞血清鈣含量(P0.05);日糧中添加4 mg/kg維生素K_3顯著降低了21日齡肉雞血清CREA水平(P0.05)。在d 42,與日糧中添加維生素K_3相比,不添加維生素K_3導(dǎo)致腿病發(fā)生率顯著增加(P0.05)。4.2肉雞血清鈣磷標(biāo)志物、血漿激素水平結(jié)果顯示:與日糧中不添加維生素K_3組相比,日糧中添加0.5 mg/kg維生素K_3提高了21日齡肉雞血清OCN水平(P0.05),降低21日齡肉雞血清BALP水平(P0.05),日糧中添加4 mg/kg維生素K_3降低21日齡肉雞血清BALP水平(P0.05)。與日糧中不添加維生素K_3組相比,日糧中添加0.5 mg/kg維生素K_3組提高肉雞42日齡血清OCN水平(P0.05),顯著降低肉雞血清BALP水平(P0.05)。與日糧中不添加維生素K_3組相比,日糧中添加4 mg/kg維生素K_3顯著提高42日齡肉雞血清OCN水平(P0.05),降低42日齡肉雞血清BALP水平(P0.05)。與日糧中不添加維生素K_3組相比,日糧添加0.5 mg/kg維生素K_3降低21日齡肉雞血漿PTH水平(P0.05),日糧中添加4 mg/kg維生素K_3降低21日齡肉雞PTH水平(P0.05)且提高了肉雞血漿CT水平(P0.05)。4.3肉雞骨骼質(zhì)量指標(biāo)及脛骨化學(xué)組成與不添加維生素K_3組相比,日糧中添加4 mg/kg K_3提高了21日齡肉雞脛骨中鈣的含量和鈣磷比(P0.05);日糧中添加0.5 mg/kg VK_3增加了21日齡肉雞脛骨中的灰分含量(P0.05);日糧中添加4 mg/kg VK_3顯著降低了42日齡肉雞脛骨磷的含量和增加了鈣磷比(P0.05);日糧中添加0.5 mg/kg和4 mg/kg VK_3都顯著增加了42日齡肉雞脛骨灰分的含量(P0.05)。與日糧中不添加維生素K_3組相比,日糧中添加4 mg/kg VK_3增加了21日齡肉雞的脛骨強(qiáng)度(P0.05);日糧中添加0.5 mg/kg VK_3和4 mg/kg VK_3組增加了42日齡肉雞的脛骨強(qiáng)度(P0.05)。4.4肉雞脛骨成骨標(biāo)志基因mRNA水平與不添加維生素K_3組相比,日糧中添加0.5 mg/kg的維生素K_3顯著提高了21日齡OCN、RUNX2 mRNA水平(P0.05),對ALPL mRNA水平無影響(P0.05)。與不添加維生素K_3組相比,日糧中添加4 mg/kg的維生素K_3提高了21日齡ALPL、OCN、RUNX2 mRNA水平(P0.05);日糧中添加0.5mg/kg或4 mg/kg的維生素K_3提高了42日齡ALPL、RUNX2 mRNA水平(P0.05),對OCN mRNA水平無影響(P0.05)。結(jié)論:維生素K_3可促進(jìn)雞胚成骨細(xì)胞的生長及提高堿性磷酸酶的活性,并對地塞米松導(dǎo)致的成骨細(xì)胞生長抑制有緩解作用。日糧中不添加維生素K可增加腿病風(fēng)險(xiǎn),添加維生素K可以改善肉雞骨骼健康狀況,這可能與維生素K_3的添加提高了ALPL、OCN、RUNX2基因的mRNA水平有關(guān)。
【圖文】：

胞形態(tài)觀察后，培養(yǎng) 24 h，倒置顯微鏡觀察，，分后可見細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞從組織塊形或多邊形的。6 天后細(xì)胞快速增殖殖最為顯著呈鋪路石狀，原因可能是8 天后細(xì)胞達(dá)到 90%融合消化傳代。代細(xì)胞倒置顯微鏡觀察（如圖 1.1），貼體感強(qiáng)，體積較原代細(xì)胞大，分布較形、紡錘形等。細(xì)胞核呈圓形或卵圓形被染成紫紅，細(xì)胞質(zhì)被染成紫蘭色。

圖 1.2 第 2 代成骨細(xì)胞（堿性磷酸酶染色，10×20）.2.3 雞胚成骨細(xì)胞 I 型膠原染色鑒定雞胚成骨細(xì)胞 I 型膠原染色鑒定結(jié)果如圖 1.3。熒光顯微鏡下可見，I 型膠原陽性成骨細(xì)胞（a、b、c）細(xì)胞質(zhì)呈綠色，核呈藍(lán)色，陽性細(xì)胞比例達(dá) 95%以上，陰性成骨細(xì)胞（d、e、f）不顯色
【學(xué)位授予單位】：武漢輕工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S831.5

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本文編號：2633647