發(fā)布時(shí)間：2020-04-19 18:48

【摘要】：新城疫是由新城疫病毒強(qiáng)毒株感染引起的一種禽類急性、高度接觸性傳染病,對世界范圍內(nèi)的禽類養(yǎng)殖業(yè)危害極大。目前盡管本病在我國已經(jīng)得到了有效控制,但病原體仍存在于一些地區(qū),并且近年有新基因型新城疫病毒的出現(xiàn),為了解病原體的分布和病原學(xué)特征,進(jìn)一步防控和消滅本病,本研究對部分地區(qū)的病原進(jìn)行了監(jiān)測和遺傳演化分析,建立了兩種能夠快速鑒別新城疫強(qiáng)毒株的方法,對分離到的流行毒株進(jìn)行了檢測。1.2016-2017年我國部分地區(qū)新城疫病毒病原學(xué)監(jiān)測2016-2017年在我國部分地區(qū)開展了新城疫流行病學(xué)調(diào)查與病原學(xué)分析。共收集3647份樣品,分離到62株新城疫病毒。2016年分離到了 46株新城疫病毒,27株來自雞、14株來自鴨、4株來自鵝、1株來自鴿;2017年分離到16株新城疫病毒,11株來自雞、3株來自環(huán)境樣品、2株來自鴿。對F基因部分片段測序后進(jìn)行遺傳演化分析,結(jié)果表明:62株新城疫病毒分離株中有39株屬于Ⅰ類3型、13株屬于Ⅱ類Ⅱ型、3株屬于Ⅱ類基因Ⅵ型、1株為Ⅱ類基因Ⅶ型、6株NDV為國內(nèi)新出現(xiàn)的Ⅰ類的未確定基因型病毒。Ⅰ類基因3型和Ⅱ類Ⅱ型NDV為2016-2017年我國這些地區(qū)的優(yōu)勢基因型。為進(jìn)一步了解新基因型毒株及部分地區(qū)NDV優(yōu)勢基因型毒株的病原學(xué)特征,選取了 1株Ⅰ類基因3型、1株Ⅱ類基因Ⅱ型、4株新基因型分離株進(jìn)行了 F基因擴(kuò)增與同源性分析,同源性分析結(jié)果顯示Ⅰ類3型毒株與我國3型分離株同源性較高、Ⅱ類Ⅱ型分離株與La Sota同源性為99.9%、4株新基因毒株同源性高于97.9%。4株新基因型毒株的F蛋白裂解位點(diǎn)均為112E-RR-Q-E-R-L117符合新城疫病毒弱毒的裂解位點(diǎn)序列,均有12個(gè)半胱氨酸和6個(gè)糖基化位點(diǎn),與其他Ⅰ類新城疫病毒的F蛋白功能區(qū)比較均未出現(xiàn)蛋白替換。利用F基因高變區(qū)建立系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示:這4株毒株與Ⅰ類1-10型的bootstrap75,遺傳關(guān)系較遠(yuǎn),不能歸屬為Ⅰ類1-10型,為Ⅰ類新基因分型毒株,利用F基因編碼區(qū)全長序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)這4株毒均屬于基因1c亞型,與北美分離株同源關(guān)系更近。為進(jìn)一步了解我國新基因型毒株的基因組特征,選取了寧夏分離株duck/Ningxia/2209/2016(以下簡稱為NX2209)進(jìn)行基因組擴(kuò)增,基因組全長為15198 nt,同源性分析結(jié)果顯示,NX2209屬于Ⅰ類新城疫病毒。2.新城疫病毒強(qiáng)弱毒雙重RT-PCR方法的建立及應(yīng)用分別設(shè)計(jì)了 1對強(qiáng)毒和1對弱毒的引物,建立了可區(qū)分NDV強(qiáng)毒和弱毒的一步法雙重RT-PCR方法,對新城疫病毒強(qiáng)毒可以擴(kuò)增出353 bp和228 bp的雙條帶,弱毒僅可以擴(kuò)增出一條353 bp的單條帶。靈敏性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn)結(jié)果表明,該方法可檢測到的最低核酸拷貝數(shù)為1.1×105和1.7×105,能夠檢測到的最低RNA的濃度為0.02 pg/μL;使用9種臨床常見的禽類病毒(禽流感病毒(H5亞型、H7亞型、H9亞型)、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞減蛋下降綜合征病毒、禽腦脊髓炎病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒)進(jìn)行擴(kuò)增均未出現(xiàn)特異性條帶;使用該雙重RT-PCR與本實(shí)驗(yàn)室以前建立的快速鑒別Ⅰ類和Ⅱ類新城疫病毒的多重RT-PCR方法、國標(biāo)中鑒定NDV的方法對2017年718份臨床樣品進(jìn)行平行試驗(yàn)對照,該方法的診斷方法敏感性為98.36%,特異性為97.0%,優(yōu)于另外2種方法。測序結(jié)果顯示,本研究建立的雙重RT-PCR方法陽性符合率為90.54%。3.新城疫強(qiáng)毒NASBA檢測方法的建立及應(yīng)用通過引物篩選和條件優(yōu)化成功建立了新城疫強(qiáng)毒的NASBA檢測方法,靈敏性試驗(yàn)表明能夠檢出的核酸最低為5個(gè)拷貝數(shù),此時(shí)RNA的濃度為7.24×10-7 pg/μL;特異性試驗(yàn)表明該方法對7株禽類常見的病毒(H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、禽腦脊髓炎病毒)未擴(kuò)增出特異性條帶;選取53份樣品使用NASBA方法和新城疫病毒強(qiáng)弱毒雙重RT-PCR方法進(jìn)行平行試驗(yàn)比較,該方法的診斷方法敏感性為97.22%,特異性為94.11%,優(yōu)于RT-PCR方法。測序結(jié)果顯示,NASBA的陽性符合率為97.22%,優(yōu)于RT-PCR方法。
【圖文】：

ｄｕｃｋ／Ｊｉａｎｇｓｕ／２１４５／２０１６邋（以下簡稱邋ＪＳ２１４５邋）、ｄｕｃｋ／Ｎｉｎｇｘｉａ／２２０６／２０１６邋（邋ＮＸ２２０６邋）、逡逑ｄｕｃｋ／Ｎｉｎｇｘｉａ／２２０７／２０１６（ＮＸ２２０７）、ｄｕｃｋ／Ｎｉｎｇｘｉａ／２２０９／２０１６（ＮＸ２２０９）進(jìn)行邋ＲＴ－ＰＣＲ邋擴(kuò)增，逡逑經(jīng)鑒定均為ＮＤＶ弱毒（圖５）。逡逑２０００ｂｐ逡逑圖５邋４株Ｉ類新基因型毒株ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．邋５邋ＲＴ－ＰＣＲ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋４邋ｎｅｗ邋ｇｅｎｏｔｙｐｅ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ邋ｏｆ邋Ｃｌａｓｓ邋Ｉ逡逑Ｍ：ＤＬ２０００邋ｍａｒｋｅｒ；ｌ－４：４株分離株；５刪性對照；６：ＮＤＶ弱毒陽性對照逡逑Ｆ基因擴(kuò)X椇托蛄蟹治魷允荊ü模危粒櫻裕粒義澹鰣澹罰岸苑擲脛甑模頻鞍捉蟹治觶⑾皺義

本文編號：2633620