【摘要】：miRNAs是在真核生物中被發(fā)現的一類內源性的單鏈非編碼小RNA,其長度18-25nt左右,miRNA在不同物種間具有嚴格的保守性,具有調控基因轉錄后翻譯的作用,能夠參與多種生命活動,包括有機體的發(fā)育過程,機體的免疫過程,甚至能夠參與到腫瘤癌癥的發(fā)生和成熟脂肪細胞的形成等過程。成熟脂肪細胞的形成是一個極其復雜的生物過程,涉及到諸多因素的調控作用。成熟脂肪細胞的形成過程主要包括三個主要的階段,包括間充質干細胞形成前體脂肪細胞,前體脂肪細胞生長增殖以及前體脂肪細胞分化成為成熟脂肪細胞,這其中后兩個階段是成熟脂肪細胞形成的重要部分。本研究通過轉錄組測序的結果以及閱讀相關的文獻,選取了差異表達的miR-331-3p進行更深入研究。并通過相關實驗證明了miR-331-3p參與到豬的前體脂肪細胞增殖、分化與脂肪酸代謝過程中。主要研究結果如下:1、過表達miR-331-3p后,通過CCK8試劑分析細胞生長狀況檢測,發(fā)現細胞生長速度減慢,并且流式細胞術分析的結果處于G0/G1期細胞比例上升,S期細胞比例下降也與CCK8實驗結果相符合。過表達miR-331-3p后,利用qRT-PCR檢測了細胞周期相關基因,發(fā)現促進細胞增殖相關的基因mRNA水平均顯著降低,而抑制細胞增殖的相關基因的mRNA水平顯著升高。結果表明miR-331-3p具有抑制豬前體脂肪細胞增殖的調控作用。2、過表達miR-331-3p后,將前體脂肪細胞誘導分化并通過qRT-PCR的方法檢測miR-331-3p在前體脂肪細胞分化過程中的表達趨勢以及檢測其分化過程中前體脂肪細胞分化標志基因PPARγ的表達變化,發(fā)現miR-331-3p具有促進前體脂肪細胞分化的作用。3、利用生物信息學的方法預測到了和脂肪酸代謝相關的基因DLST和SLC25A1基因,通過雙熒光素酶報告系統熒光素酶表達量的變化驗證了DLST為miR-331-3p的靶基因,并且過表達miR-331-3p能夠顯著降低DLST mRNA水平和蛋白水平的表達。DLST基因編碼的酶存在于檸檬酸丙酮酸循環(huán)通路中,這條通路能夠將細胞合成脂肪酸的所必需的乙酰-COA從線粒體中轉運到細胞質中。根據DLST、SLC25A1基因以及其通路上下游基因特別是其中ACLY和FAS基因的熒光定量結果,過表達miR-331-3p后脂肪酸合成增加。油紅O染色以及脂滴的定量均表明過表達miR-331-3p后脂肪酸合成增加,轉染inhibitor效果均相反,也證明了miR-331-3p可以通過檸檬酸丙酮酸循環(huán)通路促進脂肪酸的合成。綜上所述,本研究系統的分析了miR-331-3p對于前體脂肪細胞增殖分化與脂肪酸累積的調控,最終證明了miR-331-3p能夠抑制前體脂肪細胞增殖,促進其分化成為成熟脂肪細胞以及能夠促進脂肪酸積累。
【圖文】：

組織總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖

1-3p 對豬前體脂肪細胞增殖、分化與脂肪酸積累的調控28圖3-2 背最長肌和背膘中miR-331-3p的qPCR結果.Figure 3-2 qPCR result of the expression level of miR-331-3p in muscle and backfat.3.2 miR-331-3p 調控的靶基因驗證3.2.1 miR-331-3p 的靶基因預測采用靶基因在線預測軟件 Targetscan：（http ://www.targetscan.org/.）、miRanda：（ http://www.microrna.org/microrna/home.do ） 和 miRWalk (http://zmf.umm.uni -heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/) 預測 miR-331-3p 的靶基因為 二氫硫辛酰胺 S-琥珀酰轉移酶 (dihydrolipoamideS-succinyltransferase，DLST) 和溶質載體家族 25 成員 1(solutecarrier family 25 member 1，SLC25A1)。發(fā)現 DLST 和 SLC25A1 基因的 3’UTR 區(qū)域均存在這 miR-331-3p 種子序列的互補區(qū)域，，并且該區(qū)域在物種之間保守 (見圖 3-3)。
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S828

【參考文獻】

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1 陳晨;胡雄貴;朱吉;任慧波;鄧緣;彭英林;;豬脂肪發(fā)育相關miRNAs的功能研究進展[J];畜牧獸醫(yī)學報;2015年12期

2 魏述東;;從萊蕪豬的保種、利用與開發(fā)談我國地方豬種資源發(fā)展[J];中國豬業(yè);2014年07期

3 胡艷霞;曾勇慶;崔志峰;楊倫;陳偉;陳其美;石元;祝洪磊;;萊蕪豬前體脂肪細胞的原代培養(yǎng)及誘導分化研究[J];畜牧獸醫(yī)學報;2012年09期

4 張紅鋒,楊慧萍,王耀發(fā);乙醇和軟脂酸誘導的脂肪肝離體細胞模型[J];華東師范大學學報(自然科學版);2002年04期

本文編號：2632126