【摘要】：隨著生產(chǎn)力水平的提升,國家大力發(fā)展畜牧業(yè),奶牛、肉牛養(yǎng)殖逐漸呈現(xiàn)規(guī)�；C械化、產(chǎn)業(yè)化,許多從前散發(fā)性流行的疫病,現(xiàn)都呈現(xiàn)群發(fā)的趨勢,從而也對病原監(jiān)測提出了更高的要求。相比以前農(nóng)戶散養(yǎng)方式不同,許多病原由于地方局限性,多呈地方性流行,如今進出口、進出境貿(mào)易的頻繁加速了這些疫病的傳播,加之某些疫病呈隱性感染,成為畜牧業(yè)的最大隱患。因此,有效的診療手段是當(dāng)今畜牧貿(mào)易檢疫重要的一環(huán)。本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技術(shù),建立針對牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛細小病毒(Bovine parvovirus,BPV)、牛副流感病毒(Bovine parainfluenza virus,BPIV)等常見病原的快速檢測方法。經(jīng)過比對GenBank中多條BVDV 1型5’-UTR基因、BPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因以及BPIV的核蛋白N基因的序列,各自設(shè)計了一對特異性引物和帶有不同熒光基團的探針,并建立了BVDV、BPV和BPIV 3種探針qRT-PCR,同時還建立了BPV和BPIV雙重TaqMan qRT-PCR檢測方法。分別通過對退火溫度、引物濃度、探針濃度等條件的雙重優(yōu)化,結(jié)果顯示,建立的三種探針qRT-PCR和雙重TaqMan qRT-PCR均具有良好的重復(fù)性和敏感性。建立的BVDV探針qRT-PCR方法,在檢測BVDV特異性時,只能特異性地檢測出BVDV,而對同科同屬病毒CSFV和同科不同屬的JEV、RABV均無法擴增,表明該法能鑒別出同科同屬的病毒,特異性強;線性關(guān)系好,以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-T-BVDV 5’-UTR建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線,相關(guān)系數(shù)達0.999%以上;敏感性高,最低能檢測到1.55個拷貝數(shù)(copies)/μL的BVDV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,比普通PCR高100000倍;重復(fù)性好,組內(nèi)和組間變異系數(shù)都小于1.7%。建立的BPV和BPIV探針qRT-PCR檢測方法,一樣具有強特異性、高敏感性和好的重復(fù)性。它們在檢測其他病原時,探針均未與非特異性模板發(fā)生結(jié)合;BPV和BPIV法檢測限度比普通PCR分別提高了10000倍和100倍;其組內(nèi)和組間重復(fù)性均小于1.65%。用建立的BPV TaqMan熒光定量檢測43份腹瀉犢牛糞便樣品時,結(jié)果BPV陽性有4份,陽性率為9.30%。在建立特異性、敏感性和重復(fù)性好的基礎(chǔ)上,建立多重?zé)晒舛縋CR,可以減少試劑、樣品的浪費,節(jié)約時間成本,提高工作效率。利用本法建立的BPV和BPIV雙重?zé)晒舛縋CR檢測牛常見病原時,僅能特異性檢出BPV和BPIV的cDNA,說明該法具有很強的特異性且探針之間互不干擾。該法最低能夠檢出2.0×10~1 copies/μL pMD18-T-BPV和2.0×10~2 copies/μL pMD18-T-BPIV,組內(nèi)和組間的重復(fù)性試驗顯示其變異系數(shù)均小于1.2%�？傊�,本研究成功建立了3種探針qRT-PCR檢測方法和1個雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法,給牛BVDV、BPV、BPIV檢測提供技術(shù)手段。
【圖文】：

北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 2019 屆碩士研究生學(xué)和一個含有抗原決定位點的羧基端，，在他們的結(jié)必須與 N 蛋白和 RNA 結(jié)合（氨基端）才能為 PP 蛋白和 L 蛋白依賴的 RNA 聚合酶兩個亞基能調(diào)節(jié)病毒 RNA 的合成[96]。非糖基化的 M 蛋白毒組裝的核心過程[97]，是病毒復(fù)制增殖過程必

圖 2 BVDV 5’UTR 基因 PCR 擴增. 2. The PCR amplification of BVDV 5’UTR 100bp DNA Marker; 1: BVDV 5’UTR PCRA Marker; 1, PCR amplification product of時熒光定量 PCR 反應(yīng)體系及條件優(yōu)的優(yōu)化，最終獲得了 BVDV TaqMan 9。VDV TaqMan 實時熒光定量 PCR 反應(yīng)體系VDV TaqMan qRT-PCR reaction system and試劑用量VolumeProbe qPCR）（2×） 10μL .5μmol/L） 0.4μL
【學(xué)位授予單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23

【參考文獻】

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本文編號：2630025