【摘要】：化膿隱秘桿菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一種共生菌,主要寄生在家畜及野生動(dòng)物的呼吸道、消化道和生殖道等黏膜處;同時(shí)也是一種條件性致病菌,可引起多種動(dòng)物不同組織的炎癥。已有研究表明,T.pyogenes具有菌毛結(jié)構(gòu),但對其菌毛的結(jié)構(gòu)和功能的研究極少。菌毛作為細(xì)菌的毒力因子之一,在細(xì)菌入侵宿主的過程中發(fā)揮重要作用。因此,對T.pyogenes的菌毛進(jìn)行深入研究對于全面揭示T.pyogenes的致病機(jī)制和指導(dǎo)T.pyogenes疫苗的開發(fā)具有積極意義。本研究克隆了T.pyogenes的三種菌毛蛋白(Fimbrial Subunit Protein,Fim)的編碼基因——fim A、fim C和fim E;制備了三種重組菌毛蛋白(recombinant Fim,rFim)——rFim A、rFim C和rFim E;并分別用三種重組蛋白制備了兔多克隆抗體。應(yīng)用三種多克隆抗體進(jìn)行檢測,我們證實(shí)只有Fim E在培養(yǎng)的T.pyogenes中表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示,在pH為7.5的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)6~10 h,T.pyogenes中Fim E的表達(dá)水平達(dá)到最高;Fim E的表達(dá)不受厭氧條件的影響,但被微需氧條件抑制。試管凝集試驗(yàn)表明,抗rFim E多克隆抗體能引起細(xì)菌發(fā)生強(qiáng)烈的凝集反應(yīng),說明Fim E表達(dá)在T.pyogenes菌體表面�？箁Fim C多克隆抗體能引起強(qiáng)烈的凝集反應(yīng),但western blot結(jié)果顯示非特異性反應(yīng),因此,用現(xiàn)有方法難以確定T.pyogenes中Fim C是否表達(dá)�？箁Fim A多克隆抗體不能引起T.pyogenes的凝集,westernblot結(jié)果顯示非特異性反應(yīng),表明在本研究的培養(yǎng)條件下Fim A在T.pyogenes中不表達(dá)或表達(dá)不良。為了對Fim E蛋白進(jìn)行深入研究,本研究制備了三株能分泌Fim E單克隆抗體(monoclonal antibodies,mAbs)的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為2E6、16F7和3A5,并制備了含有高濃度mAbs的腹水。Western blot結(jié)果表明,三種抗Fim EmAbs都可以與rFim E發(fā)生特異性反應(yīng),并能夠與T.pyogenes菌體裂解物中一種分子量約為58 kDa的蛋白發(fā)生反應(yīng)。在T.pyogenes菌體裂解物中檢測到的成分,其分子量與推測的天然Fim E蛋白的分子量相符。Dot-ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,三種mAbs只與T.pyogenes菌體裂解物反應(yīng),與T.pyogenes培養(yǎng)上清和大腸桿菌裂解物不發(fā)生反應(yīng)。上述結(jié)果表明,制備的mAbs能夠與T.pyogenes的Fim E發(fā)生相對特異的結(jié)合。對三種mAbs的反應(yīng)特性進(jìn)行進(jìn)一步分析,篩選出Fim E蛋白的兩個(gè)抗原表位區(qū),分別位于Fim E的189-277 aa和438-511 aa區(qū)域。綜上,本研究證實(shí)了培養(yǎng)的T.pyogenes中,Fim E能夠較為穩(wěn)定的表達(dá),并制備了抗Fim E的mAbs,為后續(xù)深入探討T.pyogenes的菌毛結(jié)構(gòu)及功能,提供了一定的理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【圖文】：

蘭氏陽性細(xì)菌的菌毛由多個(gè)單體菌毛蛋白組裝而成，菌毛蛋白基因的基因簇酶家族轉(zhuǎn)肽酶的基因，細(xì)胞壁表面共價(jià)結(jié)合的表面蛋白是分選酶家族中用于催化其錨定的結(jié)果[51]。期研究測定了革蘭氏陽性菌中無乳鏈球菌[51]（Streptococcus agalactiae），釀reptococcus pyogenes）的菌毛相關(guān)結(jié)構(gòu)，，后來在研究分選酶介導(dǎo)的菌毛裝配一些金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneu棒狀桿菌（Corynebacterium diphtheriae）等革蘭氏陽性菌的菌毛結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)有一些共同的特征（如都具有分選信號 LPXTG 等部分保守結(jié)構(gòu)）[53,54]。研究對 T. pyogenes 的菌毛蛋白基因進(jìn)行了相關(guān)的研究，類似于其他革蘭氏陽 pyogenes 菌毛蛋白的基因與編碼菌毛組裝和功能所需的蛋白質(zhì)的基因聚集在結(jié)構(gòu)來看，這些菌毛蛋白帶有信號肽和 LPXTG 分選信號。菌毛蛋白多肽鏈后，N 端信號肽指導(dǎo)表面蛋白通過分泌系統(tǒng)運(yùn)出胞外并被信號肽酶切除。分蛋白 C 端的分選基序 LPXTG，并在 T-G 切割肽鍵[55,56]，切割后的多肽的末位于鄰接的同類型菌毛蛋白的 N 末端的菌毛蛋白基序內(nèi)的保守賴氨酸上，轉(zhuǎn)環(huán)菌毛聚合物共價(jià)連接到細(xì)胞壁的肽聚糖上，形成交聯(lián)聚合物（圖 1-1）。最將目標(biāo)蛋白共價(jià)連接至細(xì)胞壁[57]。

注：A 菌毛聚合過程；B 菌毛聚合物的細(xì)胞壁錨定過程；C SpaB 穿插在菌毛中的過程。圖 1-2 白喉?xiàng)U菌菌毛組裝的修正模型[61]Fig. 1-2 The revised model of pilus assembly in C. diphtheriae[61]究的目的和意義pyogenes 能引起多種經(jīng)濟(jì)型家畜和野生保護(hù)動(dòng)物疾病并造成一定經(jīng)濟(jì)損失，因機(jī)制和毒力因子并依此開發(fā)新型防控手段有一定積極意義。研究擬利用原核表達(dá)的重組 T. pyogenes 菌毛蛋白免疫動(dòng)物，制備相應(yīng)的多克隆，并利用制備的抗體檢測相應(yīng)的菌毛蛋白在 T. pyogenes 純培養(yǎng)物中的表達(dá)情為深入探討 T. pyogenes 的致病機(jī)制提供部分理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61

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本文編號：2629786