發(fā)布時(shí)間：2020-04-16 08:35

【摘要】：研究背景:由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的豬流行性腹瀉(PED)疾病給廣大的豬養(yǎng)殖者們?cè)斐闪藝?yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于PEDV具有較高的變異性等原因,目前市場(chǎng)上的弱毒苗和滅毒苗無(wú)法完全滿足有效性和安全性的要求。故,迫切需要研發(fā)新型的PEDV疫苗,或者抗病毒藥物用于防治PED。格瑞弗森(Griffithsin,GRFT)蛋白是從紅藻Griffithsia sp.中提取的對(duì)冠狀病毒具有廣譜抗性的凝集素。該凝集素通過(guò)直接結(jié)合病毒囊膜蛋白上的糖鏈,抑制其與宿主細(xì)胞受體結(jié)合,從而使病毒失活。因冠狀病毒囊膜蛋白上的糖鏈一般較為保守,所以GRFT蛋白的抗病毒效果不受病毒囊膜上氨基酸易變異的影響,從而有望克服因病毒氨基酸變異所引起的變異毒株問(wèn)題。研究目的:本文嘗試檢測(cè)GRFT蛋白抗PEDV感染的活性,為PED的防治提供新的思路。研究?jī)?nèi)容:根據(jù)GRFT蛋白序列推測(cè)其基因序列并合成雙鏈DNA,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-SUMO-GRFT,誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組GRFT;然后,通過(guò)GRFT蛋白與PEDV孵育,研究GRFT蛋白對(duì)PEDV感染Vero細(xì)胞的抑制效果,并測(cè)定其抑制病毒感染的有效作用劑量;為進(jìn)一步探究GRFT對(duì)PEDV的作用靶點(diǎn),采用PNGase F處理PEDV;最后,本文對(duì)GRFT蛋白抗病毒活性在加熱、酸浴、胰蛋白酶消化處理、胃蛋白酶消化處理以及存儲(chǔ)條件等方面受到的影響進(jìn)行了初步評(píng)估。研究方法:蛋白的表達(dá)與純化,SDS-PAGE,免疫印記實(shí)驗(yàn),細(xì)胞空斑實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果:原核表達(dá)的重組GRFT蛋白對(duì)PEDV感染具有良好的抑制效果,可以作為抗PEDV感染的候選藥物。使用原核表達(dá)的重組GRFT蛋白處理PEDV后感染Vero細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組GRFT蛋白可以顯著抑制PEDV對(duì)Vero細(xì)胞的感染,而且該蛋白的抗感染效果呈劑量依賴性,1μM重組GRFT蛋白的相對(duì)空斑抑制率為95.8%,達(dá)到50%相對(duì)空斑抑制率所需的GRFT蛋白濃度為39.22 nM。GRFT蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果:本文表達(dá)的重組GRFT蛋白具有良好的熱耐受性、酸耐受性以及一定的胃蛋白酶耐受性。GRFT蛋白的存儲(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明,重組GRFT蛋白可以在4℃環(huán)境中保存至少六個(gè)月,在室溫(25℃)環(huán)境中至少可以保存3個(gè)月。研究意義:本文首次證明了重組GRFT蛋白對(duì)PEDV具有較好的抗感染效果,為PED的防治提供新的思路。
【圖文】：

圖 1.1 PEDV 病毒粒子結(jié)構(gòu)模式圖[3]Fig. 1.1 PEDV virus structure結(jié)構(gòu)股正鏈 RNA 病毒，遺產(chǎn)物質(zhì)大小約 28 Kb。研究常的 3’和 5’端非編碼區(qū)以外，還至少包含 7是：ORF1a、ORF1b、ORF3、S、E、M、N[3, 復(fù)制酶多聚蛋白 1 a、1 b 和 ORF3 輔助蛋白 3 纖突蛋白( Spike protein)、囊膜蛋白( Envelop及核衣殼蛋白( Nucleocapsid protein)4 種結(jié)構(gòu)蛋

pET28a-SUMO-GRFT 的雙酶e identification of pET28a-SU0；2：pET28a-SUMO-GRFT ble enzyme cutting results of pEMO-GRFT 的誘導(dǎo)表達(dá)與oli BL21（DE3）中，利用取離心上清液純化蛋白。PAGE 電泳分析，，實(shí)驗(yàn)結(jié)果了較強(qiáng)的目的條帶，且條篩選的重組菌成功表達(dá)了
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2629589