【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染禽引起的高度接觸性傳染病。以高熱、呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜和漿膜出血為特征,具有很高的發(fā)病率和病死率,對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的危害。NDV為單股負(fù)鏈RNA病毒,屬于單負(fù)鏈病毒目(Mononegavirales)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、禽副粘病毒屬(Avulavirus)。泛素化修飾對于蛋白的亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)和功能以及降解,都非常重要。有報道表明泛素化修飾幫助副粘病毒M蛋白出核和形成病毒樣顆粒(Virus-like particle,VLP);然而,NDV M蛋白的泛素化修飾以及泛素化修飾在病毒感染周期中的作用尚未得到鑒定。本研究通過共轉(zhuǎn)染和表達(dá)NDV Flag-M和HA-Ubiquitin,以免疫沉淀及Western Blot檢測,發(fā)現(xiàn)M蛋白存在HA-ubiquitin修飾。通過不同副粘病毒M蛋白的序列比對以及在線軟件預(yù)測分析,推測M蛋白的潛在的泛素化位點為保守賴氨酸K83、K119、K158、K222、K248和K260。通過定點突變,把相應(yīng)K位點突變?yōu)楸彼?A)或精氨酸(R),發(fā)現(xiàn)K119A、K222A、K248A、K260A、K119R、K222R、K248R、K260R的泛素化條帶有所減少,初步鑒定K119、K222、K248和K260具有泛素化修飾。副粘病毒中,NiV、hPIV、SiV以及NDV等的M蛋白可形成VLP,釋放到細(xì)胞外。有報道表明NiV和人副粘病毒5型的M蛋白的泛素化修飾,對VLP的形成至關(guān)重要。本研究中,我們分別表達(dá)野生型M蛋白或泛素化位點突變型M蛋白,檢測和比較VLP的產(chǎn)量。結(jié)果表明,突變K119和K260為A或者R,降低了VLP的形成和釋放。由于M蛋白翻譯合成后,先進(jìn)入細(xì)胞核,再出核,遷移至細(xì)胞膜,完成病毒的組裝和出芽釋放。NDV M蛋白K119位于副粘病毒保守的NES序列,而K260位于副粘病毒的NLS序列。為了探討M蛋白泛素化和M蛋白核輸出的關(guān)系,我們通過間接免疫熒光檢測,發(fā)現(xiàn)突變體K119R滯留在細(xì)胞膜,而K260R滯留在細(xì)胞核,因而影響了VLP的形成。進(jìn)一步檢測K119R和K260R蛋白突變體與宿主蛋白的相互作用,發(fā)現(xiàn)跟野生型M蛋白相比較,K119R突變導(dǎo)致跟宿主的互作蛋白增多,揭示K119泛素化可能遮蓋了蛋白互作位點,使其能順利從細(xì)胞膜釋放。綜上所述,NDV M蛋白存在泛素化修飾,且K119和K260泛素化修飾有助于VLP的出芽或釋放。
【圖文】：

毒 (Human respiratory syncytial virus，HRSV )、仙尼帕病毒 (Nipah virus，NiV )等均屬于副黏病毒成癌細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一株名為 MTH-68 的 NDV (Csa腫瘤細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制，而正常細(xì)胞幾乎不受影響。L 的細(xì)胞中，NDV 能正常復(fù)制(Mansour et al., 2011凋亡因子，這使 NDV 成為了一種有效的溶瘤病毒度為 15192 nt，依次編碼核衣殼蛋白 (Nucleocaps、基質(zhì)蛋白(Matrix protein，M )、融合蛋白 (Fusioglutinin-Neuraminidase protein，HN )和大分子蛋白因通過 RNA 編輯產(chǎn)生的兩種非結(jié)構(gòu)蛋白：V 蛋白同，新城疫病毒分為：強(qiáng)毒型、中毒型和弱毒型。，可導(dǎo)致高達(dá) 90%的死亡率，，例如 Herts/33 株；中約 10%的死亡率，例如 CS2 毒株、Mukteswar 毒株例如 La Sota 株。

抑制 IFN 刺激基因（ISG）的產(chǎn)生(Park, et al., 2003)。是通過 RNA 編輯，在 P 蛋白的 ORF 中插入兩個 G 生成，與 V 蛋白有不明確。復(fù)制和致病性其表面糖蛋白與細(xì)胞表面唾液酸類化合物結(jié)合，攻擊呼吸道上皮細(xì)胞外，感染也可通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，有時還可通過依賴于腔隙007)。進(jìn)入宿主細(xì)胞后，負(fù)鏈 RNA 基因組轉(zhuǎn)錄成正鏈 mRNA，然后翻 L 蛋白負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，也是核衣殼組裝的關(guān)鍵成分。然后，以正鏈 因組 RNA。成熟 NDV 的組裝和出芽依賴于 M 蛋白和細(xì)胞膜上的脂筏。白前體 F0 被蛋白酶裂解為 F1-F2 亞基。因此，F(xiàn) 蛋白裂解位點被認(rèn)為anda et al., 2004)。具有病毒受體識別和神經(jīng)氨酸酶活性的 HN 對 NDV eeuw et al., 2005)。也有研究表明，F(xiàn)和HN是NDV感染巨噬細(xì)胞的決定因mer-Oberdorfer et al., 2003)。最新研究表明，F(xiàn) 蛋白裂解位點保守的谷氨重要作用，Q114R 突變可減弱病毒毒力(Samal et al., 2011)。另一項研域能增強(qiáng) NDV 在雞體內(nèi)的復(fù)制和致病性(Samal et al., 2013)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

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本文編號：2628469