【摘要】：醋氨酚(APAP)是一種常見的臨床解熱鎮(zhèn)痛藥,代謝時產(chǎn)生有毒產(chǎn)物N-乙酰對苯醌亞胺,過量會導致藥物性肝損傷。目前,普遍采用APAP誘導肝細胞損傷模型進行肝臟疾病的研究。肝細胞核因子-1(HNF-1)是調(diào)控肝臟特異性基因表達的轉(zhuǎn)錄因子,谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶A1(GSTA1)作為Ⅱ相藥物代謝酶在解毒和細胞保護方面起關(guān)鍵作用,c-Jun-末端激酶(JNK)在機體中調(diào)節(jié)細胞代謝、分化,以及介導細胞凋亡。本研究采用APAP誘導藥物性肝細胞損傷模型,研究HNF-1對GSTA1的調(diào)控作用,在此基礎上,進一步開展了在肝細胞損傷中JNK信號通路與HNF-1和GSTA1的作用研究,為藥物性肝損傷治療和研發(fā)新治療靶點奠定基礎。本實驗在復制APAP誘導肝細胞損傷模型基礎上,首先研究HNF-1對GSTA1的調(diào)控作用,試驗分為8組:對照組、模型組(APAP濃度10 mM)、C2-神經(jīng)酰胺組(APAP濃度10mM和C2濃度6μM、8μM、10μM),奧替普拉組(APAP濃度10 mM和OL濃度6μM、8μM、10μM),應用試劑盒檢測細胞上清液轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)活性;采用RT-PCR法檢測肝細胞中GSTA1 mRNA的表達;應用Western blot法檢測細胞中HNF-1和GSTA1的蛋白表達;構(gòu)建重組質(zhì)粒pGSTA1-1298-LUC和GSTA1啟動子的結(jié)合位點HRE定點突變質(zhì)粒pGSTA1-ΔHNF1-LUC轉(zhuǎn)染HepG2細胞,雙熒光素酶測定系統(tǒng)檢測細胞熒光素酶相對活性。并進一步開展了在肝細胞損傷中JNK信號通路與HNF-1和GSTA1的作用研究,試驗分為7組:對照組、模型組(APAP濃度10 mM)、抑制劑組(APAP濃度10 mM和SP濃度2μM)、OL組(APAP濃度10 mM和OL濃度8μM)、C2組(APAP濃度10 mM和C2濃度8μM)、AP+SP+OL組(APAP濃度10 mM、SP濃度2μM和OL濃度8μM)和AP+SP+C2組(APAP濃度10 mM、SP濃度2μM和C2濃度8μM),應用試劑盒檢測細胞上清液轉(zhuǎn)氨酶活性及肝細胞指標(SOD、MDA、GSH和GSH-Px)水平;采用RT-PCR法檢測細胞中HNF-1和GSTA1mRNA的表達;應用Western blot法檢測細胞中JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、HNF-1、GSTA1、Bax和Caspase-3的蛋白表達量。研究結(jié)果表明:(1)APAP濃度為10 mM作用HepG2細胞10 h,成功復制肝細胞損傷模型。(2)C2與OL對肝細胞損傷作用表明,C2可以加劇由APAP誘導的肝細胞損傷,OL可以減輕肝細胞損傷,C2極顯著降低GSTA1 mRNA表達量(p0.01),OL極顯著升高GSTA1mRNA表達量(p0.01);蛋白表達情況表明,C2可以下調(diào)HNF-1和GSTA1的蛋白表達,OL上調(diào)HNF-1和GSTA1的蛋白表達。(3)HNF-1對GSTA1表達調(diào)控作用的結(jié)果顯示,構(gòu)建的pGSTA1-1298-LUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后,當降低HNF-1的蛋白表達時,肝細胞熒光素酶相對活性極顯著降低(p0.01);增加HNF-1的蛋白表達時,肝細胞熒光素酶相對活性極顯著升高(p0.01),表明HNF-1對GSTA1表達具有調(diào)節(jié)作用,且GSTA1的表達變化與HNF-1表達變化趨勢一致;構(gòu)建的HRE突變質(zhì)粒pGSTA1-ΔHNF1-LUC轉(zhuǎn)染細胞后,當HNF-1表達水平升高或降低時,肝細胞熒光素酶活性并無明顯變化,證明HNF-1對GSTA1表達調(diào)控是通過與其啟動子的結(jié)合位點HRE作用來實現(xiàn)的。(4)JNK抑制劑,C2和OL對肝細胞損傷作用結(jié)果表明,抑制劑組與OL組,轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著降低(p0.01),HNF-1與GSTA1的mRNA和蛋白表達量極顯著升高(p0.01);C2組轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著升高(p0.01),HNF-1與GSTA1的mRNA和蛋白表達量極顯著降低(p0.01);與C2組相比,AP+SP+C2組轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著降低(p0.01),HNF-1與GSTA1的mRNA和蛋白表達量極顯著上升(p0.01);AP+SP+OL組比OL組相比,HNF-1和GSTA1的mRNA和蛋白表達量無顯著變化;其他肝細胞指標均呈極顯著變化(p0.01)。表明APAP誘導的肝細胞損傷與JNK的活化有關(guān),抑制JNK可以明顯提高HNF-1和GSTA1的表達,減輕肝細胞損傷。(5)檢測細胞中p-JNK、JNK、JNK下游蛋白p-c-Jun、c-Jun和凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3的蛋白表達量,結(jié)果顯示,抑制劑組與OL組p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun的值以及Bax和Caspase-3的相對表達量均極顯著下降(p0.01);C2組極顯著上升(p0.01),AP+SP+C2組與C2組相比,p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun的值以及Bax和Caspase-3的相對表達量均極顯著下降(p0.01);AP+SP+OL組比OL組,未有明顯變化。表明在APAP誘導的肝細胞損傷中,JNK信號通路被激活,JNK磷酸化、其下游蛋白的磷酸化以及凋亡蛋白表達量上升。本研究成功復制APAP誘導的肝細胞損傷模型,GSTA1的表達可以受C2和OL的影響;HNF-1對GSTA1的表達具有調(diào)節(jié)作用;通過定點突變GSTA1的啟動子結(jié)合位點HRE,確定HNF-1對GSTA1調(diào)控作用是通過與其啟動子結(jié)合位點HRE作用來實現(xiàn)的。JNK抑制劑作用后,通過基因和蛋白水平,證明了細胞損傷與JNK信號通路有關(guān),JNK信號通路的激活,可以下調(diào)HNF-1和GSTA1的表達,加重肝細胞損傷情況;抑制JNK信號通路激活,可以上調(diào)HNF-1和GSTA1的表達,減輕肝細胞損傷程度,因此,JNK信號通路與HNF-1和GSTA1均參與藥物性肝損傷過程,并在肝細胞損傷中起到重要作用。
【圖文】：

引 言NAPQI便與親核大分子、DNA、蛋白質(zhì)的巰基基團等替代靶標反應形成加合物[23]，過程中生成大量的ROS等加重了對線粒體的損傷，造成炎癥反應的發(fā)生，引起氧化應激可激活c-Jun-末端激酶導致肝細胞損傷，最終死亡。APAP過量引起線粒體功能障礙，，氧化應激和細胞凋亡被認為對肝臟毒性的研究和發(fā)展起至關(guān)重要的作用[24,25]。

：**表示與對照組相比 p<0.01；#表示與模型組相比 p<0.05；##表示與模型組相比 p<0.01圖 3-2 C2 處理損傷細胞培養(yǎng)上清 ALT 和 AST 活性變化（ x ±s，n=4）Fig.3-2 The alterations in ALT and AST activities in culture supernatant of injured ctreated with C2 ( x ±s, n=4)：*表示與對照組相比 p<0.05圖 3-3 C2 處理正常細胞培養(yǎng)上清 ALT 和 AST 活性變化（ x ±s，n=4）Fig.3-3 The alterations in ALT and AST activities in normal cells culture supernatant twith C2 ( x ±s, n=4)
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S859.7

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 朱上林,李勤裕,王天翔,萬亮,張希衡,甘人寶;HSS、EGF對CCl_4肝細胞損傷作用的研究[J];中華消化雜志;1997年06期

2 劉元斌,可君,翁世艾,李天佑;莨菪類藥物對四氧化碳所致大鼠肝鈣積累的作用[J];河南醫(yī)科大學學報;1988年03期

3 胡垠玲;魏元元;;乙型肝炎病毒與肝細胞損傷的關(guān)系[J];國外醫(yī)學.流行病學傳染病學分冊;1988年02期

4 謝賢春;吉中和;莊輝;;乙型肝炎患者肝細胞損傷的免疫病理機制[J];國外醫(yī)學.流行病學傳染病學分冊;1988年06期

5 孫光,馮兆良,黃群穎;鎘污染區(qū)居民肝臟生化功能的研究[J];環(huán)境與健康雜志;1989年01期

6 肖億;;復方甘草酸苷注射液對乙醇誘導肝細胞損傷的保護作用[J];醫(yī)藥導報;2013年07期

7 沈建人;;肝細胞損傷時血清sFas和sFasL的變化[J];浙江臨床醫(yī)學;2006年07期

8 楊錯;劉玉蘭;張紅梅;;肝細胞損傷機制及防治藥物研究進展[J];實用藥物與臨床;2005年06期

9 陳蕾;吳皓;姚靜倩;常念;;珠蚌多糖對四氯化碳誘導肝細胞損傷的保護作用[J];中國海洋藥物;2008年02期

10 王索 ,安完德才讓,李躍華;小大黃對藥物性肝細胞損傷影響的實驗研究[J];江蘇中醫(yī)藥;2003年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 閆冰;丁安偉;張麗;;二至丸水提物對體外肝細胞損傷的保護作用[A];2010中藥炮制技術(shù)、學術(shù)交流暨產(chǎn)業(yè)發(fā)展高峰論壇論文集[C];2010年

2 南瑛;馬恒;李嘉;張昆茹;胡詠武;劉杰;樊代明;高峰;;胰島素對內(nèi)毒素間接導致肝細胞損傷的保護作用[A];中國生理學會、中國神經(jīng)科學會2005年神經(jīng)內(nèi)分泌免疫學術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2005年

3 李妍;任進;;線粒體損傷和二苯胺結(jié)構(gòu)在非甾體類抗炎藥引起的肝細胞損傷中的作用[A];2008年中國藥學會學術(shù)年會暨第八屆中國藥師周論文集[C];2008年

4 劉天龍;吳橋興;佘銳萍;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在戊型肝炎病毒感染致肝細胞損傷的作用機制[A];第五屆全國人畜共患病學術(shù)研討會論文摘要集[C];2017年

5 王莎莎;陳龍;夏樹開;江善祥;;鎘誘導肝細胞損傷及其胞內(nèi)游離Ca~(2+)穩(wěn)態(tài)失調(diào)機制探討[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會第十三次學術(shù)討論會和中國病理生理學會動物病理生理專業(yè)委員會第十二次學術(shù)討論會論文集[C];2005年

6 呂志平;趙進軍;張緒富;;保肝寧對急性肝細胞損傷過程中NF—κB的影響[A];第十二次全國中西醫(yī)結(jié)合肝病學術(shù)會議論文匯編[C];2003年

7 葉煦亭;沙繼宏;惠寧;;肝細胞損傷對鈣離子分布的影響[A];2005年全國電子顯微學會議論文集[C];2005年

8 南瑛;馬恒;李嘉;張昆茹;胡詠武;劉杰;樊代明;高峰;;胰島素對內(nèi)毒素間接導致肝細胞損傷的保護作用[A];中國生理學會、中國神經(jīng)科學會2005年神經(jīng)內(nèi)分泌免疫學術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2005年

9 曾俊;楊海燕;蔡曉洋;周海玉;黃珍;王盼;李敏;;藏藥“俄色果”對CCl4誘導HL-7702肝細胞損傷的保護作用[A];中國商品學會第五屆全國中藥商品學術(shù)大會論文集[C];2017年

10 王軼娜;楊宇;陳平;羅熒荃;章婷;;TNF-a調(diào)控fractalkine在慢性間歇低氧致肝細胞損傷中的作用[A];中華醫(yī)學會呼吸病學年會——2013第十四次全國呼吸病學學術(shù)會議論文匯編[C];2013年

相關(guān)重要報紙文章 前7條

1 記者 黃辛 見習記者 何靜;研究揭示肝細胞損傷再生之謎[N];中國科學報;2019年

2 記者 耿挺;科學家揭示肝細胞損傷再生奧秘[N];上海科技報;2019年

3 胡德榮;肝細胞損傷研究獲進展[N];中國醫(yī)藥報;2003年

4 胡德榮;肝細胞損傷研究獲重大進展[N];健康報;2003年

5 解放軍302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病科主任 劉士敬;肝功能不全=肝細胞損傷[N];保健時報;2008年

6 長沙市第三醫(yī)院 副主任醫(yī)師 王南華;“肝”著急[N];大眾衛(wèi)生報;2013年

7 毛遠麗;專家教您學看化驗單[N];農(nóng)村醫(yī)藥報（漢）;2008年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 高冠民;高血氨對肝細胞損傷和凋亡機制的研究[D];鄭州大學;2014年

2 李小松;順鉑誘導HBV再激活和肝細胞損傷的分子機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

3 姚景宏;單核/巨噬細胞TLR4介導的天然免疫反應在肝細胞損傷中的作用機制研究[D];華中科技大學;2007年

4 朱冰;抗肝炎新藥SY-801對癌變、腫瘤細胞耐藥、肝細胞損傷的作用及其機理[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;1996年

5 史華新;加味補肝散含藥血清對肝細胞損傷線粒體能量代謝的影響[D];湖北中醫(yī)藥大學;2011年

6 徐琰;鐵催化酒精誘導肝細胞損傷機理的研究[D];華中科技大學;2012年

7 王瓊?cè)~;高血氨誘導肝細胞損傷及其代謝組學的研究[D];鄭州大學;2015年

8 劉慧敏;鈣池操縱鈣離子通道在乙醇誘導肝細胞鈣超載及相關(guān)肝細胞損傷中作用的研究[D];山東大學;2012年

9 寧波;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在非酒精性脂肪性肝病肝細胞損傷中的作用及機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2009年

10 崔瑞冰;鈣池調(diào)控的鈣離子內(nèi)流在酒精導致的肝損傷中的機制的研究[D];山東大學;2016年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 張園園;醋氨酚誘導肝細胞損傷中JNK信號通路與HNF-1和GSTA1的作用研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2019年

2 赫景姍;醋氨酚誘導肝細胞損傷中JNK信號通路與GSTA1的作用研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2018年

3 王曉群;鹽酸右美托咪定對膿毒癥肝細胞損傷的保護作用[D];華北理工大學;2016年

4 金梅紅;組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在肝細胞損傷和增生中的雙向調(diào)控機制的研究[D];延邊大學;2004年

5 常軼聰;醋氨酚誘導藥物性肝細胞損傷中HNF-1調(diào)節(jié)GSTA1表達分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2017年

6 孫凌云;IGFBP2、IGFBP4在實驗性肝細胞損傷中的表達研究[D];山西醫(yī)科大學;2007年

7 羅娜;肝源磷脂酰膽堿對四氯化碳肝細胞損傷的保護作用[D];遼寧師范大學;2006年

8 牛琛;CYP1A1啟動子區(qū)甲基化在抗結(jié)核藥物致肝細胞損傷中的作用[D];華北理工大學;2017年

9 邢秀梅;三氯乙烯致L-02肝細胞損傷血清蛋白質(zhì)組分析及對Rho GDIα表達的影響[D];湖南師范大學;2008年

10 劉梁英;川芎嗪、大黃酸聯(lián)用對轉(zhuǎn)化生長因子β_1和甘油三酯致肝細胞損傷的影響[D];重慶醫(yī)科大學;2005年

本文編號：2626615