發(fā)布時間：2020-04-14 00:05

【摘要】：醋氨酚(APAP)是一種常見的臨床解熱鎮(zhèn)痛藥,代謝時產(chǎn)生有毒產(chǎn)物N-乙酰對苯醌亞胺,過量會導(dǎo)致藥物性肝損傷。目前,普遍采用APAP誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型進行肝臟疾病的研究。肝細(xì)胞核因子-1(HNF-1)是調(diào)控肝臟特異性基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶A1(GSTA1)作為Ⅱ相藥物代謝酶在解毒和細(xì)胞保護方面起關(guān)鍵作用,c-Jun-末端激酶(JNK)在機體中調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、分化,以及介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究采用APAP誘導(dǎo)藥物性肝細(xì)胞損傷模型,研究HNF-1對GSTA1的調(diào)控作用,在此基礎(chǔ)上,進一步開展了在肝細(xì)胞損傷中JNK信號通路與HNF-1和GSTA1的作用研究,為藥物性肝損傷治療和研發(fā)新治療靶點奠定基礎(chǔ)。本實驗在復(fù)制APAP誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型基礎(chǔ)上,首先研究HNF-1對GSTA1的調(diào)控作用,試驗分為8組:對照組、模型組(APAP濃度10 mM)、C2-神經(jīng)酰胺組(APAP濃度10mM和C2濃度6μM、8μM、10μM),奧替普拉組(APAP濃度10 mM和OL濃度6μM、8μM、10μM),應(yīng)用試劑盒檢測細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)活性;采用RT-PCR法檢測肝細(xì)胞中GSTA1 mRNA的表達(dá);應(yīng)用Western blot法檢測細(xì)胞中HNF-1和GSTA1的蛋白表達(dá);構(gòu)建重組質(zhì)粒pGSTA1-1298-LUC和GSTA1啟動子的結(jié)合位點HRE定點突變質(zhì)粒pGSTA1-ΔHNF1-LUC轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,雙熒光素酶測定系統(tǒng)檢測細(xì)胞熒光素酶相對活性。并進一步開展了在肝細(xì)胞損傷中JNK信號通路與HNF-1和GSTA1的作用研究,試驗分為7組:對照組、模型組(APAP濃度10 mM)、抑制劑組(APAP濃度10 mM和SP濃度2μM)、OL組(APAP濃度10 mM和OL濃度8μM)、C2組(APAP濃度10 mM和C2濃度8μM)、AP+SP+OL組(APAP濃度10 mM、SP濃度2μM和OL濃度8μM)和AP+SP+C2組(APAP濃度10 mM、SP濃度2μM和C2濃度8μM),應(yīng)用試劑盒檢測細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)氨酶活性及肝細(xì)胞指標(biāo)(SOD、MDA、GSH和GSH-Px)水平;采用RT-PCR法檢測細(xì)胞中HNF-1和GSTA1mRNA的表達(dá);應(yīng)用Western blot法檢測細(xì)胞中JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、HNF-1、GSTA1、Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)量。研究結(jié)果表明:(1)APAP濃度為10 mM作用HepG2細(xì)胞10 h,成功復(fù)制肝細(xì)胞損傷模型。(2)C2與OL對肝細(xì)胞損傷作用表明,C2可以加劇由APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,OL可以減輕肝細(xì)胞損傷,C2極顯著降低GSTA1 mRNA表達(dá)量(p0.01),OL極顯著升高GSTA1mRNA表達(dá)量(p0.01);蛋白表達(dá)情況表明,C2可以下調(diào)HNF-1和GSTA1的蛋白表達(dá),OL上調(diào)HNF-1和GSTA1的蛋白表達(dá)。(3)HNF-1對GSTA1表達(dá)調(diào)控作用的結(jié)果顯示,構(gòu)建的pGSTA1-1298-LUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,當(dāng)降低HNF-1的蛋白表達(dá)時,肝細(xì)胞熒光素酶相對活性極顯著降低(p0.01);增加HNF-1的蛋白表達(dá)時,肝細(xì)胞熒光素酶相對活性極顯著升高(p0.01),表明HNF-1對GSTA1表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用,且GSTA1的表達(dá)變化與HNF-1表達(dá)變化趨勢一致;構(gòu)建的HRE突變質(zhì)粒pGSTA1-ΔHNF1-LUC轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,當(dāng)HNF-1表達(dá)水平升高或降低時,肝細(xì)胞熒光素酶活性并無明顯變化,證明HNF-1對GSTA1表達(dá)調(diào)控是通過與其啟動子的結(jié)合位點HRE作用來實現(xiàn)的。(4)JNK抑制劑,C2和OL對肝細(xì)胞損傷作用結(jié)果表明,抑制劑組與OL組,轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著降低(p0.01),HNF-1與GSTA1的mRNA和蛋白表達(dá)量極顯著升高(p0.01);C2組轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著升高(p0.01),HNF-1與GSTA1的mRNA和蛋白表達(dá)量極顯著降低(p0.01);與C2組相比,AP+SP+C2組轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著降低(p0.01),HNF-1與GSTA1的mRNA和蛋白表達(dá)量極顯著上升(p0.01);AP+SP+OL組比OL組相比,HNF-1和GSTA1的mRNA和蛋白表達(dá)量無顯著變化;其他肝細(xì)胞指標(biāo)均呈極顯著變化(p0.01)。表明APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷與JNK的活化有關(guān),抑制JNK可以明顯提高HNF-1和GSTA1的表達(dá),減輕肝細(xì)胞損傷。(5)檢測細(xì)胞中p-JNK、JNK、JNK下游蛋白p-c-Jun、c-Jun和凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示,抑制劑組與OL組p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun的值以及Bax和Caspase-3的相對表達(dá)量均極顯著下降(p0.01);C2組極顯著上升(p0.01),AP+SP+C2組與C2組相比,p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun的值以及Bax和Caspase-3的相對表達(dá)量均極顯著下降(p0.01);AP+SP+OL組比OL組,未有明顯變化。表明在APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中,JNK信號通路被激活,JNK磷酸化、其下游蛋白的磷酸化以及凋亡蛋白表達(dá)量上升。本研究成功復(fù)制APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型,GSTA1的表達(dá)可以受C2和OL的影響;HNF-1對GSTA1的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用;通過定點突變GSTA1的啟動子結(jié)合位點HRE,確定HNF-1對GSTA1調(diào)控作用是通過與其啟動子結(jié)合位點HRE作用來實現(xiàn)的。JNK抑制劑作用后,通過基因和蛋白水平,證明了細(xì)胞損傷與JNK信號通路有關(guān),JNK信號通路的激活,可以下調(diào)HNF-1和GSTA1的表達(dá),加重肝細(xì)胞損傷情況;抑制JNK信號通路激活,可以上調(diào)HNF-1和GSTA1的表達(dá),減輕肝細(xì)胞損傷程度,因此,JNK信號通路與HNF-1和GSTA1均參與藥物性肝損傷過程,并在肝細(xì)胞損傷中起到重要作用。
【圖文】：

引 言NAPQI便與親核大分子、DNA、蛋白質(zhì)的巰基基團等替代靶標(biāo)反應(yīng)形成加合物[23]，過程中生成大量的ROS等加重了對線粒體的損傷，造成炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引起氧化應(yīng)激可激活c-Jun-末端激酶導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，最終死亡。APAP過量引起線粒體功能障礙，，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡被認(rèn)為對肝臟毒性的研究和發(fā)展起至關(guān)重要的作用[24,25]。

：**表示與對照組相比 p<0.01；#表示與模型組相比 p<0.05；##表示與模型組相比 p<0.01圖 3-2 C2 處理損傷細(xì)胞培養(yǎng)上清 ALT 和 AST 活性變化（ x ±s，n=4）Fig.3-2 The alterations in ALT and AST activities in culture supernatant of injured ctreated with C2 ( x ±s, n=4)：*表示與對照組相比 p<0.05圖 3-3 C2 處理正常細(xì)胞培養(yǎng)上清 ALT 和 AST 活性變化（ x ±s，n=4）Fig.3-3 The alterations in ALT and AST activities in normal cells culture supernatant twith C2 ( x ±s, n=4)
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S859.7

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本文編號：2626615