發(fā)布時間：2020-04-13 00:47

【摘要】：禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis virus,ALV)引起的以造血細胞惡性增生為主要特征的多種腫瘤性疾病的總稱。因其能引起腫瘤,造成產(chǎn)蛋量下降,且能使機體產(chǎn)生嚴重的免疫抑制,故對養(yǎng)禽業(yè)危害巨大。禽白血病的控制目前只能依靠種群凈化,篩選到能抗禽白血病病毒的特效藥對該病的防治具有重要意義。研究顯示,A亞型和J亞型禽白血病病毒是威脅我省家禽業(yè)的主要亞型。本研究首先對貴州省J亞型禽白血病病毒流行毒株進行PCR鑒定及序列分析,從其分子生物學特性推測近幾年貴州省禽白血病病毒的流行特點,同時以J亞型標準毒株為對象,從18種中藥中篩選出對其復制有抑制作用的中藥,并對中藥的最佳作用方式作進一步探索。研究結(jié)果為禽白血病的防治奠定了基礎(chǔ)。1.貴州省ALV-J臨床病例檢測及gp85序列分析:本研究設(shè)計了一對J亞型禽白血病病毒特異性引物,對25例臨床病例進行PCR擴增,鑒定出17例ALV-J陽性病例,陽性率為68%(17/25)。選取其中3例ALV-J亞型陽性病例病料,對其gp85基因進行克隆、測序分析、生物學軟件分析。結(jié)果顯示:(1)3株流行株(GZ161219、GZ170813和GZ180116)gp85基因大小均為924bp,核苷酸相似性在98.3%-99.5%之間,流行株與J亞型參考株AHaq02(Gen Bank登錄號:KF534753)相似性最高,為98.2%-99.7%,與其它亞型標準株的相似性僅為49.1%-51.2%;(2)用DNAStar軟件對3株流行株的gp85基因進行推導,3者均能編碼308個氨基酸,氨基酸序列相似性分析結(jié)果與核苷酸相一致,與J亞型標準株HPRS-103(Gen Bank登錄號:Z45390)和GZN49(Gen Bank登錄號:KX077613)相比,突變率低于3%;(3)對3株流行株gp85推導的氨基酸進行二級結(jié)構(gòu)的預測,結(jié)果顯示無規(guī)卷曲的含量最高,其次是延伸鏈,α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角含量最低。預測gp85基因編碼蛋白的B細胞表位各參數(shù),結(jié)果顯示,gp85基因編碼蛋白具有較好的親水性,氨基酸柔性區(qū)域分布較均勻,抗原指數(shù)和表面可及性都較高,綜合各參數(shù),得到了gp85蛋白可能的優(yōu)勢表位。3株流行株的gp85蛋白主要存在gp85蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域,均不存在跨膜結(jié)構(gòu),也無信號肽存在。研究結(jié)果為貴州省J亞型禽白血病病毒流行毒株的生物學特性和流行變異情況提供參考數(shù)據(jù)。2.ALV p27原核表達及其高免血清的制備:(1)設(shè)計一對p27基因特異性引物,將目的基因克隆至p Cold I質(zhì)粒、轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21、經(jīng)IPTG誘導表達、超聲裂解,用SDS-PAGE檢測。結(jié)果,可見26k D大小的特異條帶,重組蛋白His-p27主要以包涵體的形式存在。(2)重組蛋白鎳柱純化后,免疫健康小鼠、采集血清、ELISA測其效價、Western Blotting鑒定。結(jié)果表明,本研究成功獲得了針對p27蛋白的高免血清,其血清效價為1:3200,研究結(jié)果為ALV的檢測及研究p27蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。3.中藥最大安全濃度的測定:選取18種中藥(黃芪、貫眾、雞血藤、墨旱蓮、黃芩、赤芍、仙鶴草、丹參、蒲公英、益母草、白花蛇舌草、淫羊藿、丹皮、郁金、夏枯草、土茯苓、梔子、魚腥草),采用水煎法制備中藥藥液,并用細胞病變法和MTT法對中藥的最大安全濃度(TC0)進行測定,結(jié)果顯示:(1)不同的中藥細胞毒性不同。(2)18種中藥中細胞毒性最小的是黃芪,TC0為62.5mg/m L;毒性最大的是貫眾,TC0為0.061mg/m L,且部分中藥對細胞的毒性會隨作用時間的增加逐漸增大。(3)兩種檢測方法相比,MTT法更為敏感、準確,故選擇MTT法的測定結(jié)果作為藥物的TC0。測定結(jié)果可為下一步實驗奠定基礎(chǔ)。4.不同中藥對ALV轉(zhuǎn)錄水平的影響:用ALV p27抗原檢測試劑盒對ALV毒株的TCID50進行測定,并用Reed-Muench法計算結(jié)果,測得該病毒的TCID50為10-3.8/0.1 m L。參考較為保守的gp37基因以及18sr RNA基因序列設(shè)計熒光引物,構(gòu)建標準質(zhì)粒,成功建立了特異性強、擴增效率高的標準曲線。設(shè)立分直接滅活組、預防組和治療組3個組別,將中藥和病毒分別或同時接種于DF-1細胞,于37℃培養(yǎng)72h后,提取各孔的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成c DNA,以18sr RNA為內(nèi)參基因,進行q PCR,得到Ct值,用2-ΔΔCt方法計算差異。結(jié)果表明,黃芪在細胞水平對ALV gp37基因m RNA表達的抑制作用最強;郁金、益母草、土茯苓也有一定的抑制作用;梔子、赤芍、蒲公英及貫眾對ALV gp37基因m RNA表達幾乎沒有影響。
【圖文】：

貴州大學 2018 屆碩士學位論文個亞群，由王鑫等分離并命名，與其它幾個亞群同源性較毒血癥,并誘發(fā)一定比例的淋巴細胞腫瘤（王鑫等，2012；Mi態(tài)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄病毒，形狀為類球形（圖 1），直徑約為 80~14層，內(nèi)層是直徑約為 40nm 的核芯，包含二倍體 RNA、反酶(IN)，中層是病毒的衣殼，呈 20 面體對稱，外層為囊突（Bova C.Aet al., 1986;Feng M et al.,2016）。

圖 2 ALV 基因組結(jié)構(gòu)Fig 2 The genomic structure ofALVgag 基因約 2100bp 左右大小，gag 基因編碼的多聚前體蛋白 Pr76 在蛋白酶 p15作用下，會形成 3~6 種非糖結(jié)構(gòu)蛋白，從氨基端到竣基端依次為基質(zhì)蛋白 p19 (MA)，， p10，病毒群特異性抗原衣殼蛋白 p27 (CA)，參與核酸加工的核衣殼蛋白 p12 (NA)，與蛋白前體剪切的天冬氨酸酶蛋白酶 p15 (PR)。p27 是 ALV 的主要群特異性抗原，序高度保守，存在許多易于檢測的病毒抗原位點，是制備抗體的首選抗原。p2，，p10 的體功能尚不清楚（Zhang et al.,2010;Thuy et al.,1999）。pol 基因約為 2610bp 左右，編碼的蛋白經(jīng)蛋白酶 p15 剪切產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄酶 p68（RT）整合酶 p32（IN）。RT 分子量大小為 68kDa，負責將病毒 RNA 反轉(zhuǎn)錄成前病毒 DNA， 則負責將前病毒 DNA 整合到宿主染色體中（Calnek et al., 1997;Liu X et al.,2015）。gag 基因和 pol 基因較為保守，各亞群間的同源性高達 95~99%，而 J 亞群的 env因與 A、C、D 三個亞群的同源性僅有 41%左右，這很大程度上是受了 env 基因編碼
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65;S853.7

【參考文獻】

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本文編號：2625383