【摘要】：禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis virus,ALV)引起的以造血細(xì)胞惡性增生為主要特征的多種腫瘤性疾病的總稱。因其能引起腫瘤,造成產(chǎn)蛋量下降,且能使機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制,故對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害巨大。禽白血病的控制目前只能依靠種群凈化,篩選到能抗禽白血病病毒的特效藥對(duì)該病的防治具有重要意義。研究顯示,A亞型和J亞型禽白血病病毒是威脅我省家禽業(yè)的主要亞型。本研究首先對(duì)貴州省J亞型禽白血病病毒流行毒株進(jìn)行PCR鑒定及序列分析,從其分子生物學(xué)特性推測(cè)近幾年貴州省禽白血病病毒的流行特點(diǎn),同時(shí)以J亞型標(biāo)準(zhǔn)毒株為對(duì)象,從18種中藥中篩選出對(duì)其復(fù)制有抑制作用的中藥,并對(duì)中藥的最佳作用方式作進(jìn)一步探索。研究結(jié)果為禽白血病的防治奠定了基礎(chǔ)。1.貴州省ALV-J臨床病例檢測(cè)及gp85序列分析:本研究設(shè)計(jì)了一對(duì)J亞型禽白血病病毒特異性引物,對(duì)25例臨床病例進(jìn)行PCR擴(kuò)增,鑒定出17例ALV-J陽性病例,陽性率為68%(17/25)。選取其中3例ALV-J亞型陽性病例病料,對(duì)其gp85基因進(jìn)行克隆、測(cè)序分析、生物學(xué)軟件分析。結(jié)果顯示:(1)3株流行株(GZ161219、GZ170813和GZ180116)gp85基因大小均為924bp,核苷酸相似性在98.3%-99.5%之間,流行株與J亞型參考株AHaq02(Gen Bank登錄號(hào):KF534753)相似性最高,為98.2%-99.7%,與其它亞型標(biāo)準(zhǔn)株的相似性僅為49.1%-51.2%;(2)用DNAStar軟件對(duì)3株流行株的gp85基因進(jìn)行推導(dǎo),3者均能編碼308個(gè)氨基酸,氨基酸序列相似性分析結(jié)果與核苷酸相一致,與J亞型標(biāo)準(zhǔn)株HPRS-103(Gen Bank登錄號(hào):Z45390)和GZN49(Gen Bank登錄號(hào):KX077613)相比,突變率低于3%;(3)對(duì)3株流行株gp85推導(dǎo)的氨基酸進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),結(jié)果顯示無規(guī)卷曲的含量最高,其次是延伸鏈,α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角含量最低。預(yù)測(cè)gp85基因編碼蛋白的B細(xì)胞表位各參數(shù),結(jié)果顯示,gp85基因編碼蛋白具有較好的親水性,氨基酸柔性區(qū)域分布較均勻,抗原指數(shù)和表面可及性都較高,綜合各參數(shù),得到了gp85蛋白可能的優(yōu)勢(shì)表位。3株流行株的gp85蛋白主要存在gp85蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域,均不存在跨膜結(jié)構(gòu),也無信號(hào)肽存在。研究結(jié)果為貴州省J亞型禽白血病病毒流行毒株的生物學(xué)特性和流行變異情況提供參考數(shù)據(jù)。2.ALV p27原核表達(dá)及其高免血清的制備:(1)設(shè)計(jì)一對(duì)p27基因特異性引物,將目的基因克隆至p Cold I質(zhì)粒、轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、超聲裂解,用SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果,可見26k D大小的特異條帶,重組蛋白His-p27主要以包涵體的形式存在。(2)重組蛋白鎳柱純化后,免疫健康小鼠、采集血清、ELISA測(cè)其效價(jià)、Western Blotting鑒定。結(jié)果表明,本研究成功獲得了針對(duì)p27蛋白的高免血清,其血清效價(jià)為1:3200,研究結(jié)果為ALV的檢測(cè)及研究p27蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。3.中藥最大安全濃度的測(cè)定:選取18種中藥(黃芪、貫眾、雞血藤、墨旱蓮、黃芩、赤芍、仙鶴草、丹參、蒲公英、益母草、白花蛇舌草、淫羊藿、丹皮、郁金、夏枯草、土茯苓、梔子、魚腥草),采用水煎法制備中藥藥液,并用細(xì)胞病變法和MTT法對(duì)中藥的最大安全濃度(TC0)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示:(1)不同的中藥細(xì)胞毒性不同。(2)18種中藥中細(xì)胞毒性最小的是黃芪,TC0為62.5mg/m L;毒性最大的是貫眾,TC0為0.061mg/m L,且部分中藥對(duì)細(xì)胞的毒性會(huì)隨作用時(shí)間的增加逐漸增大。(3)兩種檢測(cè)方法相比,MTT法更為敏感、準(zhǔn)確,故選擇MTT法的測(cè)定結(jié)果作為藥物的TC0。測(cè)定結(jié)果可為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。4.不同中藥對(duì)ALV轉(zhuǎn)錄水平的影響:用ALV p27抗原檢測(cè)試劑盒對(duì)ALV毒株的TCID50進(jìn)行測(cè)定,并用Reed-Muench法計(jì)算結(jié)果,測(cè)得該病毒的TCID50為10-3.8/0.1 m L。參考較為保守的gp37基因以及18sr RNA基因序列設(shè)計(jì)熒光引物,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,成功建立了特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高的標(biāo)準(zhǔn)曲線。設(shè)立分直接滅活組、預(yù)防組和治療組3個(gè)組別,將中藥和病毒分別或同時(shí)接種于DF-1細(xì)胞,于37℃培養(yǎng)72h后,提取各孔的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成c DNA,以18sr RNA為內(nèi)參基因,進(jìn)行q PCR,得到Ct值,用2-ΔΔCt方法計(jì)算差異。結(jié)果表明,黃芪在細(xì)胞水平對(duì)ALV gp37基因m RNA表達(dá)的抑制作用最強(qiáng);郁金、益母草、土茯苓也有一定的抑制作用;梔子、赤芍、蒲公英及貫眾對(duì)ALV gp37基因m RNA表達(dá)幾乎沒有影響。
【圖文】：

貴州大學(xué) 2018 屆碩士學(xué)位論文個(gè)亞群，由王鑫等分離并命名，與其它幾個(gè)亞群同源性較毒血癥,并誘發(fā)一定比例的淋巴細(xì)胞腫瘤（王鑫等，2012；Mi態(tài)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄病毒，形狀為類球形（圖 1），直徑約為 80~14層，內(nèi)層是直徑約為 40nm 的核芯，包含二倍體 RNA、反酶(IN)，中層是病毒的衣殼，呈 20 面體對(duì)稱，外層為囊突（Bova C.Aet al., 1986;Feng M et al.,2016）。

圖 2 ALV 基因組結(jié)構(gòu)Fig 2 The genomic structure ofALVgag 基因約 2100bp 左右大小，gag 基因編碼的多聚前體蛋白 Pr76 在蛋白酶 p15作用下，會(huì)形成 3~6 種非糖結(jié)構(gòu)蛋白，從氨基端到竣基端依次為基質(zhì)蛋白 p19 (MA)，， p10，病毒群特異性抗原衣殼蛋白 p27 (CA)，參與核酸加工的核衣殼蛋白 p12 (NA)，與蛋白前體剪切的天冬氨酸酶蛋白酶 p15 (PR)。p27 是 ALV 的主要群特異性抗原，序高度保守，存在許多易于檢測(cè)的病毒抗原位點(diǎn)，是制備抗體的首選抗原。p2，，p10 的體功能尚不清楚（Zhang et al.,2010;Thuy et al.,1999）。pol 基因約為 2610bp 左右，編碼的蛋白經(jīng)蛋白酶 p15 剪切產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄酶 p68（RT）整合酶 p32（IN）。RT 分子量大小為 68kDa，負(fù)責(zé)將病毒 RNA 反轉(zhuǎn)錄成前病毒 DNA， 則負(fù)責(zé)將前病毒 DNA 整合到宿主染色體中（Calnek et al., 1997;Liu X et al.,2015）。gag 基因和 pol 基因較為保守，各亞群間的同源性高達(dá) 95~99%，而 J 亞群的 env因與 A、C、D 三個(gè)亞群的同源性僅有 41%左右，這很大程度上是受了 env 基因編碼
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65;S853.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2625383