【摘要】：牛結(jié)核病是由分枝桿菌屬的牛分枝桿菌引起的一種人畜共患的慢性消耗性傳染病。目前,對(duì)于結(jié)核病的防治主要以預(yù)防為主,而卡介苗是用于預(yù)防結(jié)核病的唯一疫苗,但其免疫效果并不穩(wěn)定。因此,開發(fā)研究新型高效的結(jié)核病疫苗依然是當(dāng)下牛結(jié)核病防治的首要任務(wù)。病毒載體是構(gòu)建重組疫苗相對(duì)理想的候選載體,其中復(fù)制缺陷型腺病毒載體在結(jié)核病疫苗研究中使用廣泛。近幾年來,由于單個(gè)蛋白基因制成的疫苗,其抗原性往往不甚理想,因此,將多個(gè)具有保護(hù)效果的抗原基因融合,制成活載體病毒疫苗成為了很多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究以復(fù)制缺陷型人5型腺病毒為表達(dá)載體,構(gòu)建表達(dá)牛分枝桿菌mpb83和ag85b融合基因的重組腺病毒,并在小鼠模型中進(jìn)行免疫研究分析。本研究方法是以質(zhì)粒pMD-83-85bL作為模板,PCR擴(kuò)增目的基因mpb83-ag85b并構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pacAd5CMV-83-85b。通過PacⅠ限制性內(nèi)切酶作用下對(duì)其與腺病毒骨架質(zhì)粒pacAd5 9.2-100分別線性化,在轉(zhuǎn)染試劑LipoFiter?的作用下共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行重組腺病毒的包裝。獲得重組腺病毒命名為rAd5-CMV-83-85b并對(duì)目的基因進(jìn)行PCR鑒定。大量擴(kuò)增并進(jìn)行純化,同時(shí)測定其病毒滴度。間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA),反轉(zhuǎn)錄PCR試驗(yàn)(RT-PCR)和Western blotting進(jìn)一步檢測目的基因mpb83-ag85b在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)。對(duì)小鼠進(jìn)行免疫,加強(qiáng)免疫一次,利用流式細(xì)胞儀對(duì)各組免疫小鼠脾內(nèi)的T淋巴細(xì)胞亞群和分泌IL-2,IFN-γ等細(xì)胞因子的淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測,同時(shí)利用間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)對(duì)免疫小鼠血清中IgG進(jìn)行檢測。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、成功構(gòu)建重組腺病毒穿梭載體pacAd5CMV-83-85b和獲得重組腺病毒rAd5-CMV-83-85b;2、通過IFA和RT-PCR檢測MPB83-Ag85B融合蛋白在體外能夠表達(dá)并具有生物學(xué)活性;3、血清學(xué)水平檢測到rAd5-CMV-83-85b組免疫小鼠的IgG水平高于其他三組且差異顯著(P0.05)。淋巴細(xì)胞檢測顯示rAd5-CMV-83-85b組小鼠體內(nèi)的CD4~+T淋巴細(xì)胞數(shù)高于0.9%NaCl組、rAd-CMV-NpA組差異顯著(P0.05),低于BCG組差異不顯著(P0.05)。CD8~+T淋巴細(xì)胞檢測分析結(jié)果rAd5-CMV-83-85b高于0.9%NaCl組和rAd-CMV-NpA組差異顯著(P0.05),高于BCG組差異不顯著(P0.05)。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞因子結(jié)果分析顯示rAd5-CMV-83-85b組分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)高于空載腺病毒組和0.9%NaCl組且均差異顯著(P0.05),比BCG組低但差異不顯著(P0.05)。分泌IL-2的淋巴細(xì)胞數(shù)高于空載腺病毒組和0.9%NaCl組且差異顯著(P0.05),略低于BCG組差異不顯著(P0.05)。通過血清學(xué)水平檢測和流式檢測結(jié)果分析表明重組腺病毒rAd5-CMV-83-85b能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng),具有較好的免疫原性。通過對(duì)重組腺病毒疫苗rAd5-CMV-83-85b的研究,為進(jìn)一步研究其作為牛結(jié)核病疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

mpb83-ag85bPCR結(jié)果

圖 1-2 雙酶切鑒定結(jié)果 2000 Marker M2: Marker/λDNA Hind Ⅲ 1: 酶Fig.1-2 Double enzyme digestion identification rearker M2: Marker/λDNA Hind Ⅲ 1: Recombienzyme穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒 pacAd5 9.2-100 線性性內(nèi)切酶的作用下對(duì)骨架質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒架質(zhì)粒在 32947bp 處和 2000bp 處有條帶實(shí)預(yù)期結(jié)果相符，說明穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 賈紅;鑫婷;郭曉宇;袁維峰;侯紹華;朱鴻飛;;牛結(jié)核病對(duì)人類健康的影響及其診斷方法[J];微生物與感染;2014年01期

2 張占龍;;對(duì)牛結(jié)核病的診斷與防治的探討[J];中國畜禽種業(yè);2009年07期

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本文編號(hào)：2625182