【摘要】：布魯氏菌(Brucella)是革蘭陰性兼性胞內(nèi)寄生菌,其所引起的布魯氏菌病(Brucellosis)在世界范圍內(nèi)流行,給養(yǎng)殖業(yè)和公共健康造成嚴(yán)重危害。布魯氏菌主要感染牛、綿羊和山羊,引起懷孕母畜流產(chǎn)和雄性動物不育。人類感染布魯氏菌病主要呈現(xiàn)慢性持續(xù)性感染,表現(xiàn)波浪熱、全身乏力、多汗以及關(guān)節(jié)疼痛等癥狀。布魯氏菌作為胞內(nèi)寄生性細(xì)菌,其獨特的胞內(nèi)生存策略對于布魯氏菌的致病性具有關(guān)鍵作用。Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣsecretion systems,T4SS)是布魯氏菌的重要毒力因子,在介導(dǎo)布魯氏菌胞內(nèi)存活和抑制宿主免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。VceC是布魯氏菌T4SS分泌的效應(yīng)蛋白,研究其在宿主細(xì)胞中的生存及作用機制,對于闡明布魯氏菌病的發(fā)生機制和有效防控具有重要意義。本試驗通過構(gòu)建PUC19G-Vce C同源重組載體并轉(zhuǎn)入豬布魯氏菌S2株(B.suis S2)感受態(tài)細(xì)胞中,通過PCR篩選獲得VceC缺失菌株(ΔVceC);利用ΔVceC菌株侵染山羊滋養(yǎng)層細(xì)胞(goat trophoblast cells,GTC),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測GTC凋亡情況,同時用Western Blot檢測凋亡通路標(biāo)志蛋白cleaved caspase3、pro-caspase9以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)相關(guān)性促凋亡分子CHOP的表達(dá)情況,探究ΔVceC菌株對GTC凋亡的影響;此外,通過檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)專有伴侶分子GRP78以及未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,探究ΔVceC菌株侵染GTC對ERS以及UPR通路的影響,利用Tm和4-PBA改變GTC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài),檢測ΔVceC菌株侵染GTC對其胞內(nèi)增殖的影響。試驗結(jié)果如下:1.克隆布魯氏菌VceC基因上、下游同源臂以及慶大霉素基因,構(gòu)建布魯氏菌同源重組載體PUC19G-VceC,將其轉(zhuǎn)入B.suis S2感受態(tài)細(xì)胞,通過PCR篩選獲得ΔVceC菌株。2.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測ΔVceC菌株侵染GTC在12 h、24 h、48 h后的細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果表明ΔVceC菌株促進(jìn)了GTC凋亡。Western Blot檢測凋亡通路蛋白cleaved caspase3、pro-caspase9和CHOP表達(dá)量,結(jié)果顯示cleaved caspase3和CHOP表達(dá)量上調(diào),而pro-caspase9的表達(dá)量差異不顯著,表明ΔVceC菌株可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路引起宿主細(xì)胞的凋亡。3.用ΔVceC菌株侵染GTC,通過Western Blot檢測結(jié)果顯示在侵染24 h和48 h后,GRP78的表達(dá)量顯著降低(P0.01),表明ΔVceC菌株侵染GTC可引起其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。進(jìn)一步檢測激活UPR信號通路的相關(guān)蛋白,結(jié)果顯示,ΔVceC菌株在侵染GTC24 h和48 h后,磷酸化的IRE1表達(dá)量相對于B.suis S2是下調(diào)的,而eIF2α、ATF6-α和ATF6-β表達(dá)量無顯著差異,提示VceC參與布魯氏菌介導(dǎo)的IRE1信號通路的激活。此外,利用Tm和4-PBA改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài),檢測ΔVceC菌株侵染GTC對其胞內(nèi)增殖的影響,結(jié)果顯示用0.5μg/mL Tm預(yù)處理GTC,與B.suis S2組相比,增加GTC內(nèi)GRP78表達(dá)量的同時顯著地抑制了ΔVceC菌株在GTC內(nèi)的增殖;反之,用1μM 4-PBA預(yù)處理GTC,與B.suis.S2組相比,ΔVceC菌株組降低了GTC內(nèi)GRP78的表達(dá)量的同時顯著增加了ΔVceC菌株在GTC內(nèi)的增殖,說明不同的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)對ΔVceC菌株在GTC內(nèi)的增殖具有影響。
【圖文】：

未折疊蛋白反應(yīng)是真核細(xì)胞中分泌和跨膜蛋白合成，折疊和加工的主要細(xì)胞器。炎癥和氧化應(yīng)激在內(nèi)的病理刺激都會打破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)功能，導(dǎo)，這種狀況被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。大量研究表明，ERS 在各種心血血性心臟病和動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中起著重要作用。質(zhì)錯誤折疊過程中，蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的積累激活適應(yīng)性反應(yīng)蛋白質(zhì)反應(yīng)（Unfolded protein response,UPR）（Kadowaki et al. 器檢測到 UPR 信號通路包括 IRE1，蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PRK）和轉(zhuǎn)錄激活因子 6（activating transcription factor 6，ATF6）Schuck et al. 2009）。如果 UPR 不能恢復(fù)正常并緩解 ERS，將誘促凋亡分子 C/EP 同源蛋白（C/EP homologous protein，，CHOP）通路，IRE1 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 2 介導(dǎo)的凋亡通路以及圖 1-1 布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存周期（Ke et al. 2015）Fig. 1-1 The life cycle of Brucella within host cells

ceC 重組質(zhì)粒 10 μL 和布魯氏菌感受態(tài) 100 μL 于離杯中，置于電轉(zhuǎn)儀中，電壓 1.8 KV，點擊時間 6 mB 培養(yǎng)液，置 37℃恒溫?fù)u床中 180 rpm/min 24 h。液涂于 TSA 慶大霉素抗性平板上，培養(yǎng) 72 h。篩選中取出 TSA 平板培養(yǎng)基，挑出生長狀況良好的單抗性培養(yǎng)基的 10 mL 離心管中，置于 37℃搖床中 h 菌液。采用 PCR 方法鑒定篩選菌株，并將篩選正。染色鑒定結(jié)果.suis S2 滅活菌液進(jìn)行革蘭染色，鏡檢結(jié)果如圖 2-1性菌，油鏡下觀察顯示為單個散在呈短桿狀或球狀
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.614

【參考文獻(xiàn)】

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1 卿蕊;向晴可;劉眾齊;肖非;陽帆;;不同鋁佐劑明顯增強布魯菌外膜蛋白31(Omp31)的免疫接種效果[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2018年02期

2 陳淑英;張敬軍;時朝輝;林勇;;布魯氏菌病防治研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)動物防制;2016年09期

3 高彥輝;趙麗軍;孫殿軍;顧愛華;張作文;董爾丹;;布魯氏菌病防治基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀與展望[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2014年06期

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本文編號：2625060