【摘要】：剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)可寄生于多種動物的有核細胞。目前缺乏針對弓形蟲病的具體治療方案,因此有必要開發(fā)研制有效的弓形蟲疫苗,了解弓形蟲的免疫逃避機制是研制新型疫苗的重要一步。弓形蟲感染宿主時可激發(fā)宿主的天然免疫反應(yīng)以清除弓形蟲:一方面通過IFN-γ激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1),引起巨噬細胞等細胞產(chǎn)生過量的活性氧(ROS)來殺傷弓形蟲,另一方面通過IFN-γ誘導(dǎo)的免疫相關(guān)GTP酶(IRGs)信號通路募集IRGs到納蟲泡膜(PVM)上裂解納蟲泡(PV),進而通過細胞自噬清除蟲體。弓形蟲則可分泌多種因子逃避免疫攻擊:一方面,弓形蟲可產(chǎn)生多種過氧化物酶以抵抗活性氧(ROS)的損傷,本實驗室前期研究表明在弓形蟲分泌的排泄抗原(ESA)中存在大量的硫氧還蛋白還原酶(TR),在逃避宿主的活性氧損傷中發(fā)揮重要的抗氧化作用,使得弓形蟲在宿主體內(nèi)生存并繁殖。另一方面,有研究表明棒狀體蛋白18(ROP18)能特異性結(jié)合宿主細胞內(nèi)的IRGs,防止宿主免疫作用對PV的破壞,進而避免弓形蟲裸露而遭到宿主細胞質(zhì)中ROS的攻擊并逃避細胞自噬。所以我們推測ROP18和TR有可能在弓形蟲抵抗宿主的免疫清除過程中發(fā)揮協(xié)同作用,基于此假設(shè)我們開展了以下實驗。首先,進行了ROP18蛋白的表達及多克隆抗體的制備。采用PCR方法擴增ROP18的截短基因,構(gòu)建pET-30a-ROP18重組質(zhì)粒進行蛋白表達。ROP18蛋白以包涵體形式表達,故采用KCl染色切膠法回收目的蛋白,并免疫雌性昆明小鼠制備多克隆抗體。間接免疫熒光(IFA)試驗顯示ROP18主要分布于弓形蟲速殖子的胞漿內(nèi),且棒狀體常存在的部位呈現(xiàn)較強熒光。本研究成功獲得重組蛋白ROP18及ROP18多克隆抗體,為ROP18特性與功能的研究奠定基礎(chǔ)。其次,進行了ROP18基因缺失株(RH-ROP18-KO株)和互補株(RH-ROP18-CO株)的構(gòu)建及生物學(xué)功能的研究。運用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功獲得了RH-ROP18-KO株和RH-ROP18-CO株。與RH株相比,RH-ROP18-KO株的體外入侵細胞能力及增殖速率降低、對小鼠的毒力減弱,同時采用反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)的方法擴增巨噬細胞的Irga6基因,構(gòu)建pGEX-6p-1-Irga6重組質(zhì)粒進行蛋白表達,免疫雌兔獲得多克隆抗體用于IFA試驗,結(jié)果顯示Irga6在RH-ROP18-KO株P(guān)V表面聚集的熒光強度明顯高于RH株,佐證了ROP18可通過磷酸化Irga6阻止其在PVM上聚集,從而防止PV被破壞。最后,為探索ROP18與TR在弓形蟲抵抗宿主的免疫清除過程中是否發(fā)揮協(xié)同作用,進行了TR基因缺失株、ROP18和TR雙基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)功能的研究。同樣運用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),在RH株基礎(chǔ)上缺失TR基因,息瘧定篩選獲得TR基因缺失株(RH-TR-KO株);同時構(gòu)建具有氯霉素抗性的ROP18單基因缺失蟲株,再在此蟲株基礎(chǔ)上缺失TR基因,用息瘧定進行篩選以獲得ROP18和TR雙基因缺失株(RH-ROP18-TR-KO株)。RH-ROP18-TR-KO株的體外入侵細胞能力及增殖速率比RH株及單基因缺失蟲株低,通過小鼠的毒力實驗顯示RH-ROP18-TR-KO株感染小鼠的存活時間比RH株及單基因缺失蟲株感染的小鼠存活時間要長,這些研究表明ROP18和TR可能通過具有協(xié)同作用的不同機制來逃避宿主的免疫攻擊。
【圖文】：

文 TP）從細胞質(zhì)遷移到無毒力的弓形蟲的 PVM 上06; Martens et al., 2005)。在上調(diào) IFN-γ 后，將 IRG PV 的囊泡化、破裂以及弓形蟲的死亡(Howard et ，不同類型的弓形蟲蟲株對于聚集 IRGs 到 PVMGs 到 PVM 上，因此它們的速殖子能有效地被宿御因子來阻斷宿主細胞的清除機制，因此它們能繁aylor, 2007)。細胞還通過產(chǎn)生氧化應(yīng)激微環(huán)境來抵抗弓形蟲(H粒細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞可通過釋放超氧導(dǎo)致氧化應(yīng)激微環(huán)境，對弓形蟲產(chǎn)生毒性(Engin

士學(xué)位論文 細胞期間，棒狀體蛋白可由弓形蟲直接分泌到宿主細胞中。其中細胞質(zhì)中的絲氨酸（Ser）/蘇氨酸（Thr）激酶，被鑒定為主要的r et al., 2006)。在分泌到宿主細胞后，ROP5 和 ROP18 通過富含 NH）結(jié)構(gòu)域連接到 PVM 的細胞胞質(zhì)面(Etheridge et al., 2014; Fen012; Reese and Boothroyd, 2009)。ROP18 的作用對象為免疫相關(guān) PVM 上積累，從而保護 PV 的完整性并免于被破壞(Fentress et al.,einfeldt et al., 2010)。有研究表明，ROP18 可促進 P65 蛋白的降解，，ROP18 在 ROP5 和 GRA7 的調(diào)控下可直接磷酸化 Irga6(Herma促進 ROP18 激酶活性(Behnke et al., 2012)，，隨后 ROP18 激酶 al., 2012; Niedelman et al., 2012; Reese et al., 2014)。此外，弓形蟲徑，ROP18 可通過體外線粒體凋亡途徑抑制宿主細胞凋亡(Wu e弓形蟲的存活。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.72

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 郭敏;;羊弓形蟲病的診斷與防治[J];當(dāng)代畜牧;2018年29期

2 金冬輝;;羊弓形蟲病的診治[J];養(yǎng)殖與飼料;2019年06期

3 羅瀟;張莉;呂艷;李海龍;;我國弓形蟲病誤診現(xiàn)狀及其研究進展[J];中國病原生物學(xué)雜志;2018年05期

4 李秀萍;薛�，�;王剛;金蓮軍;;青海省湖東種羊場羊弓形蟲病流行病學(xué)的調(diào)查[J];青海畜牧獸醫(yī)雜志;2017年01期

5 宋玉英;;家兔弓形蟲病的防治[J];中國養(yǎng)兔;2017年03期

6 胡小林;;羊弓形蟲病的診斷與防治[J];湖南畜牧獸醫(yī);2017年05期

7 何彥春;李珊;李旭蓉;錢振波;;甘肅省張掖市動物弓形蟲病血清學(xué)調(diào)查[J];中國動物檢疫;2016年03期

8 馬超鋒;;河南信陽地區(qū)羊弓形蟲病的血清流行病學(xué)調(diào)查[J];畜牧與獸醫(yī);2016年09期

9 馬超鋒;孫何云;張軼;饒兵;;河南信陽犬弓形蟲病血清流行病學(xué)調(diào)查[J];中國獸醫(yī)雜志;2016年09期

10 肖思宇;呂芳麗;;眼弓形蟲病的臨床研究進展[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2014年10期

相關(guān)會議論文 前10條

1 薛書江;董雪艷;劉全;許應(yīng)天;;籠養(yǎng)黑熊弓形蟲病血清流行病學(xué)調(diào)查[A];中國動物學(xué)會寄生蟲學(xué)專業(yè)委員會第十屆全國寄生蟲學(xué)青年工作者學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2016年

2 黃建榮;;弓形蟲病診治進展[A];全國寄生蟲病高峰論壇暨2016年浙江省熱帶病與寄生蟲病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2016年

3 趙鵬;張守發(fā);賈立軍;于龍政;;吉林省長春地區(qū)牛弓形蟲病流行病學(xué)調(diào)查[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)寄生蟲學(xué)分會第十三次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2015年

4 王正松;聶浩;方瑞;肖犟;馮輝輝;涂攀;周艷琴;趙俊龍;;湖北省規(guī)�；i場弓形蟲病動態(tài)流行病學(xué)調(diào)查[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜寄生蟲學(xué)分會第六次代表大會暨第十次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

5 劉文韜;路義鑫;鹿凌巖;穆永才;劉俊超;戴麗梅;宋銘忻;;黑龍江省部分地區(qū)牛弓形蟲病血清學(xué)調(diào)查[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜寄生蟲學(xué)分會第六次代表大會暨第十次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

6 李輝;張健;;一例犬弓形蟲病的診斷與治療[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會小動物醫(yī)學(xué)分會第四次學(xué)術(shù)研討會、中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)外科學(xué)分會第十六次學(xué)術(shù)研討會論文集（2）[C];2009年

7 李祥瑞;;弓形蟲病的流行的新趨勢[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會食品衛(wèi)生學(xué)分會第十一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

8 崔平;秦建華;方素芳;;河北省動物弓形蟲病流行病學(xué)調(diào)查[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜寄生蟲學(xué)分會第五次代表大會暨第八次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2004年

9 朱引潔;吳文學(xué);賀國強;;弓形蟲病的診斷現(xiàn)狀[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜寄生蟲學(xué)分會第九次學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2006年

10 孫秀濤;謝銀杰;楊建發(fā);李樹榮;段綱;鄒豐才;;云南省部分地區(qū)家畜弓形蟲病血清流行病學(xué)調(diào)查[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜寄生蟲學(xué)分會第六次代表大會暨第十次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 陸琦;天津工大開展弓形蟲病數(shù)學(xué)模型研究[N];科學(xué)時報;2011年

2 小郭;弓形蟲病危害不輕[N];中國商報;2000年

3 記者 周俏春;專家敬告：“準媽媽”慎養(yǎng)貓[N];新華每日電訊;2003年

4 戴培紅;北京友誼醫(yī)院探索治療弓形蟲病的新途徑[N];中國醫(yī)藥報;2000年

5 杜長明;當(dāng)心寵物身上的“寵物”[N];中國醫(yī)藥報;2001年

6 王志海 邵芹;犬弓形蟲病[N];中國畜牧報;2003年

7 臨城縣畜牧局 李路民;豬得弓形蟲病 吃了貓的虧[N];河北科技報;2002年

8 李水源;當(dāng)前豬場弓形蟲病的防控[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2013年

9 劉延年;家畜弓形蟲病的防治[N];中國畜牧水產(chǎn)報;2001年

10 邢臺市獸醫(yī)院 邢蘭君 高社朝;豬高燒不退 沒準是弓形蟲病[N];河北科技報;2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王萌;弓形蟲感染早期家貓小腸轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

2 王銘;弓形蟲移動聯(lián)結(jié)復(fù)合物成員棒狀體頸部蛋白4的功能研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

3 陳小慶;不同基因型弓形蟲多組學(xué)分析及其對小鼠肝脾代謝組的影響[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

4 聞慧琴;弓形蟲多態(tài)性毒力相關(guān)效應(yīng)分子GRA15_Ⅱ/ROP 16_(Ⅰ/Ⅲ)致小鼠不良妊娠結(jié)局的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

5 劉卿;弓形蟲MIC6/7/8及GRA15互作蛋白的篩選、鑒定及GRA15對宿主細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

6 韓亞莉;弓形蟲扁菱形蛋白酶4和組織蛋白酶C1的免疫學(xué)研究[D];山東大學(xué);2018年

7 徐穎;弓形蟲RH、PRU和VEG蟲株中ROP38功能的比較研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

8 張曉;雌二醇和孕酮對弓形蟲侵染的影響及其機制[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

9 司進;弓形蟲病免疫診斷及靶向生物治療的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2005年

10 王洪法;弓形蟲ROP2基因在大腸桿菌和卡介苗中的表達及免疫原性的研究[D];吉林大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 段倩玉;弓形蟲TR基因與ROP18基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

2 劉輝;弓形蟲表面抗原糖蛋白相關(guān)序列SRS47D生物學(xué)特性的初步研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

3 白夢捷;弓形蟲致密顆粒蛋白基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

4 陳運通;弓形蟲自噬相關(guān)蛋白TgATG12促進TgATG8在頂質(zhì)體外膜定位的分子機制研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

5 張雅嶺;弓形蟲病免疫膠體金診斷試紙條的研制[D];廣西大學(xué);2014年

6 朱丙倫;剛地弓形蟲SHR蟲株生物學(xué)特性初步研究[D];廣西大學(xué);2015年

7 馮q

本文編號：2624088