【摘要】：剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)可寄生于多種動(dòng)物的有核細(xì)胞。目前缺乏針對(duì)弓形蟲病的具體治療方案,因此有必要開(kāi)發(fā)研制有效的弓形蟲疫苗,了解弓形蟲的免疫逃避機(jī)制是研制新型疫苗的重要一步。弓形蟲感染宿主時(shí)可激發(fā)宿主的天然免疫反應(yīng)以清除弓形蟲:一方面通過(guò)IFN-γ激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1),引起巨噬細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(ROS)來(lái)殺傷弓形蟲,另一方面通過(guò)IFN-γ誘導(dǎo)的免疫相關(guān)GTP酶(IRGs)信號(hào)通路募集IRGs到納蟲泡膜(PVM)上裂解納蟲泡(PV),進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞自噬清除蟲體。弓形蟲則可分泌多種因子逃避免疫攻擊:一方面,弓形蟲可產(chǎn)生多種過(guò)氧化物酶以抵抗活性氧(ROS)的損傷,本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明在弓形蟲分泌的排泄抗原(ESA)中存在大量的硫氧還蛋白還原酶(TR),在逃避宿主的活性氧損傷中發(fā)揮重要的抗氧化作用,使得弓形蟲在宿主體內(nèi)生存并繁殖。另一方面,有研究表明棒狀體蛋白18(ROP18)能特異性結(jié)合宿主細(xì)胞內(nèi)的IRGs,防止宿主免疫作用對(duì)PV的破壞,進(jìn)而避免弓形蟲裸露而遭到宿主細(xì)胞質(zhì)中ROS的攻擊并逃避細(xì)胞自噬。所以我們推測(cè)ROP18和TR有可能在弓形蟲抵抗宿主的免疫清除過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同作用,基于此假設(shè)我們開(kāi)展了以下實(shí)驗(yàn)。首先,進(jìn)行了ROP18蛋白的表達(dá)及多克隆抗體的制備。采用PCR方法擴(kuò)增ROP18的截短基因,構(gòu)建pET-30a-ROP18重組質(zhì)粒進(jìn)行蛋白表達(dá)。ROP18蛋白以包涵體形式表達(dá),故采用KCl染色切膠法回收目的蛋白,并免疫雌性昆明小鼠制備多克隆抗體。間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn)顯示ROP18主要分布于弓形蟲速殖子的胞漿內(nèi),且棒狀體常存在的部位呈現(xiàn)較強(qiáng)熒光。本研究成功獲得重組蛋白R(shí)OP18及ROP18多克隆抗體,為ROP18特性與功能的研究奠定基礎(chǔ)。其次,進(jìn)行了ROP18基因缺失株(RH-ROP18-KO株)和互補(bǔ)株(RH-ROP18-CO株)的構(gòu)建及生物學(xué)功能的研究。運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功獲得了RH-ROP18-KO株和RH-ROP18-CO株。與RH株相比,RH-ROP18-KO株的體外入侵細(xì)胞能力及增殖速率降低、對(duì)小鼠的毒力減弱,同時(shí)采用反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)的方法擴(kuò)增巨噬細(xì)胞的Irga6基因,構(gòu)建pGEX-6p-1-Irga6重組質(zhì)粒進(jìn)行蛋白表達(dá),免疫雌兔獲得多克隆抗體用于IFA試驗(yàn),結(jié)果顯示Irga6在RH-ROP18-KO株P(guān)V表面聚集的熒光強(qiáng)度明顯高于RH株,佐證了ROP18可通過(guò)磷酸化Irga6阻止其在PVM上聚集,從而防止PV被破壞。最后,為探索ROP18與TR在弓形蟲抵抗宿主的免疫清除過(guò)程中是否發(fā)揮協(xié)同作用,進(jìn)行了TR基因缺失株、ROP18和TR雙基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)功能的研究。同樣運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),在RH株基礎(chǔ)上缺失TR基因,息瘧定篩選獲得TR基因缺失株(RH-TR-KO株);同時(shí)構(gòu)建具有氯霉素抗性的ROP18單基因缺失蟲株,再在此蟲株基礎(chǔ)上缺失TR基因,用息瘧定進(jìn)行篩選以獲得ROP18和TR雙基因缺失株(RH-ROP18-TR-KO株)。RH-ROP18-TR-KO株的體外入侵細(xì)胞能力及增殖速率比RH株及單基因缺失蟲株低,通過(guò)小鼠的毒力實(shí)驗(yàn)顯示RH-ROP18-TR-KO株感染小鼠的存活時(shí)間比RH株及單基因缺失蟲株感染的小鼠存活時(shí)間要長(zhǎng),這些研究表明ROP18和TR可能通過(guò)具有協(xié)同作用的不同機(jī)制來(lái)逃避宿主的免疫攻擊。
【圖文】：

文 TP）從細(xì)胞質(zhì)遷移到無(wú)毒力的弓形蟲的 PVM 上06; Martens et al., 2005)。在上調(diào) IFN-γ 后，將 IRG PV 的囊泡化、破裂以及弓形蟲的死亡(Howard et ，不同類型的弓形蟲蟲株對(duì)于聚集 IRGs 到 PVMGs 到 PVM 上，因此它們的速殖子能有效地被宿御因子來(lái)阻斷宿主細(xì)胞的清除機(jī)制，因此它們能繁aylor, 2007)。細(xì)胞還通過(guò)產(chǎn)生氧化應(yīng)激微環(huán)境來(lái)抵抗弓形蟲(H粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可通過(guò)釋放超氧導(dǎo)致氧化應(yīng)激微環(huán)境，對(duì)弓形蟲產(chǎn)生毒性(Engin

士學(xué)位論文 細(xì)胞期間，棒狀體蛋白可由弓形蟲直接分泌到宿主細(xì)胞中。其中細(xì)胞質(zhì)中的絲氨酸（Ser）/蘇氨酸（Thr）激酶，被鑒定為主要的r et al., 2006)。在分泌到宿主細(xì)胞后，ROP5 和 ROP18 通過(guò)富含 NH）結(jié)構(gòu)域連接到 PVM 的細(xì)胞胞質(zhì)面(Etheridge et al., 2014; Fen012; Reese and Boothroyd, 2009)。ROP18 的作用對(duì)象為免疫相關(guān) PVM 上積累，從而保護(hù) PV 的完整性并免于被破壞(Fentress et al.,einfeldt et al., 2010)。有研究表明，ROP18 可促進(jìn) P65 蛋白的降解，，ROP18 在 ROP5 和 GRA7 的調(diào)控下可直接磷酸化 Irga6(Herma促進(jìn) ROP18 激酶活性(Behnke et al., 2012)，，隨后 ROP18 激酶 al., 2012; Niedelman et al., 2012; Reese et al., 2014)。此外，弓形蟲徑，ROP18 可通過(guò)體外線粒體凋亡途徑抑制宿主細(xì)胞凋亡(Wu e弓形蟲的存活。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.72

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本文編號(hào)：2624088