【摘要】：札幌病毒(sapovirus,Sa V)屬于杯狀病毒科(Caliciviridae)、札幌樣病毒屬(Sappora-like virus),是單股正鏈的一種RNA病毒。可以引起人和動(dòng)物的急性病毒性胃腸炎及腹瀉,通常通過糞便和口腔交叉感染。豬札幌病毒(Porcine Sapovirus,Po Sa V)能夠引起仔豬腹瀉并廣泛存在于世界范圍內(nèi)。近年來,Sa V的研究?jī)?nèi)容相對(duì)較少,最新研究顯示,Sa V能夠感染多種物種,不同基因型的Sa V在遺傳進(jìn)化方面和抗原表位上有很多相似之處,并且已發(fā)現(xiàn)來自于人源和豬源重組的Sa V毒株,說明Sa V存在一定的跨種傳播能力,嚴(yán)重時(shí)會(huì)對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在的威脅。因此,研究較方便的ELISA診斷方法和免疫原性較好、安全性較高的預(yù)防性疫苗抗擊病毒感染是一個(gè)緊迫的任務(wù)。VP1序列為豬Sa V(Porcine Sapovirus,Po Sa V)的主要衣殼蛋白組成成分,可分為S區(qū)和P區(qū)。以Sa V(CH430株)的RNA作為擴(kuò)增模板得到目的基因并將其克隆到p ET-30a載體中,并將成功構(gòu)建的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。純化出Po Sa V的VP1以及S區(qū)和P區(qū)蛋白,分別將S蛋白和P蛋白進(jìn)行HRP標(biāo)記,通過優(yōu)化ELISA包被濃度和封閉時(shí)間,一抗二抗稀釋度,封閉時(shí)間等條件成功建立了Po Sa V雙抗原夾心ELISA,為Sa V的血清學(xué)診斷提供了依據(jù)。同時(shí)將原核表達(dá)的VP1、P、S蛋白純化后分別免疫了家兔和仔豬,制備了兩種動(dòng)物源的高免血清,為研究免疫原性和蛋白檢測(cè)等提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。VP1是Po Sa V virus-like particles(VLPs)組裝的必需區(qū),將Po Sa V VP1編碼蛋白的基因序列插入p Fast BacTM HTB載體中,轉(zhuǎn)入DH10BACTM感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)成陽性重組桿粒;用重組陽性的桿粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞得到重組桿狀病毒,將其感染細(xì)胞至第三代桿狀病毒,提取桿狀病毒RNA和DNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定外源基因沒有丟失;采用TCID50方法確定重組病毒滴度;將重組病毒感染sf9細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)。表達(dá)的蛋白通過共聚焦顯微鏡以及Western-blots試驗(yàn)證明外源基因成功在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá),相對(duì)分子質(zhì)量為58-61k Da,與預(yù)測(cè)蛋白大小一致,并且為非分泌型蛋白,主要分布在細(xì)胞核周圍以及細(xì)胞質(zhì)中。蛋白經(jīng)過濃縮處理后,進(jìn)行蔗糖密度梯度離心純化,通過電子顯微鏡觀察VLPs大小和形態(tài)均模擬天然病毒結(jié)構(gòu)。同時(shí),將Po Sa V VLPs免疫仔豬,通過建立的雙抗原夾心ELISA方法檢測(cè)抗體的生成并且穩(wěn)定后,進(jìn)行了攻毒試驗(yàn),免疫組的仔豬可以有效地抑制病毒在腸道內(nèi)的復(fù)制,而對(duì)照組不能抑制病毒的復(fù)制。證明VLPs刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體能夠阻止機(jī)體組織與病毒表面的抗原結(jié)合,阻止病毒黏附靶細(xì)胞受體,防止侵入細(xì)胞,從而起到保護(hù)的作用。Sa V-VLP疫苗對(duì)于豬Sa V的防治具有良好的前景,可作為預(yù)防豬Sa V的疫苗之一,本研究為Po Sa V基因工程亞單位疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.4;S852.65

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本文編號(hào)：2623968