【摘要】：圍產(chǎn)期奶牛由于食欲下降,干物質攝入減少,而能量需求增多,容易引起能量負平衡。在這種狀態(tài)下,機體會大量動員脂肪組織,以彌補能量需求。脂肪動員產(chǎn)生游離脂肪酸,其在肝臟不完全氧化會產(chǎn)生大量酮體,容易導致奶牛酮病。酮病奶牛表現(xiàn)為系統(tǒng)性氧化應激,而代謝旺盛的脂肪組織是否存在氧化應激,目前尚不清楚。熱休克蛋白(HSPs)是機體由于受到化學、物理和生物因子等刺激而導致應激反應發(fā)生時產(chǎn)生的抵抗應激的一類蛋白質。近幾年發(fā)現(xiàn),熱休克蛋白B7(HSPB7)在抗氧化、保護機體損傷等方面發(fā)揮重要作用,然而,在酮病奶牛脂肪組織中HSPB7是否有抗氧化作用,目前尚不清楚。此外,眾所周知核因子E2相關因子2(NFE2L2)在機體內(nèi)主要參與抗氧化過程,HSPB7與NFE2L2信號通路是否有聯(lián)系,還待進一步研究。因此,本實驗通過體內(nèi)采集臨床酮病奶牛和健康奶牛脂肪組織,檢測臨床酮病奶牛脂肪組織中是否存在氧化應激及HSPB7和NFE2L2的表達變化。體外分離培養(yǎng)犢牛脂肪細胞,分別添加不同濃度的H_2O_2,模擬體內(nèi)氧化應激狀態(tài),研究犢牛脂肪細胞氧化應激對HSPB7、NFE2L2及其下游靶基因血紅素氧合酶-1(HMOX1)和NADH醌氧化還原酶1(NQO1)的影響,并通過轉染過表達HSPB7的腺病毒和干擾HSPB7的siRNA,以期了解HSPB7對犢牛脂肪細胞抗氧化應激的作用及機制。體內(nèi)實驗測定了健康奶牛和臨床酮病奶牛脂肪組織中抗氧化應激指標超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性和氧化應激指標丙二醛(MDA)的含量,結果表明臨床酮病奶牛脂肪組織中的MDA含量顯著高于健康奶牛,而SOD和GSH-Px活性顯著低于健康奶牛,說明臨床酮病奶牛脂肪組織中存在氧化應激。同時,檢測了脂肪組織中HSPB7和NFE2L2的表達量,結果表明,臨床酮病奶牛脂肪組織中HSPB7和NFE2L2的表達量均高于健康奶牛,說明HSPB7在臨床酮病奶牛脂肪組織中發(fā)揮作用,且NFE2L2信號通路被激活。體外培養(yǎng)犢牛脂肪細胞,添加不同濃度的H_2O_2(0、25、50、100、200和400μM)作用2 h。結果表明,與對照組相比,添加H_2O_2濃度為25、50、100、200和400μM的實驗組活性氧(ROS)和MDA的含量隨著H_2O_2濃度增加而顯著升高,SOD和GSH-Px的活性隨著H_2O_2濃度增加而顯著降低。此外,25、50和100μM H_2O_2促進HSPB7和NFE2L2 mRNA和蛋白表達,并促進NFE2L2下游靶基因HMOX1和NQO1的mRNA表達,而200和400μM H_2O_2抑制HSPB7和NFE2L2 mRNA和蛋白表達,并抑制NFE2L2下游靶基因HMOX1和NQO1的mRNA表達。體外培養(yǎng)犢牛脂肪細胞,轉染過表達HSPB7的腺病毒(Ad-HSPB7)作用48 h,添加200μM H_2O_2作用2 h。結果表明,過表達HSPB7減弱H_2O_2對NFE2L2、HMOX1和NQO1表達的抑制作用,且過表達HSPB7增加SOD和GSH-Px的活性,降低MDA和ROS的產(chǎn)生,從而改善H_2O_2誘導的氧化應激。將脂肪細胞轉染小干擾RNA(si-HSPB7)48 h,添加200μM H_2O_2作用2 h。結果表明,干擾HSPB7加劇H_2O_2對NFE2L2、HMOX1和NQO1表達的抑制作用,且干擾HSPB7加劇H_2O_2對SOD和GSH-Px活性的降低,并增加MDA和ROS的產(chǎn)生,表明干擾HSPB7會加重犢牛脂肪細胞中的氧化應激。以上結果表明,臨床酮病奶牛脂肪組織存在氧化應激,且HSPB7和NFE2L2的表達升高。在犢牛脂肪細胞中,HSPB7通過激活NFE2L2信號通路發(fā)揮抗氧化作用。
【圖文】：

脂肪組織 TG 分解生成的 NEFA 是某些代謝性疾病炎，也是奶牛過渡期代謝性疾�。ㄖ靖�、酮癥）和感染性）的重要誘導因素[40,41]。高濃度 NEFA 可激活炎癥通路，因子 α（tumor necrosis factor α, TNF-α）、白介素因子的期奶牛對乳腺炎、子宮炎等感染性疾病很敏感。進入肝臟外，也可在肝細胞中重新酯化生成 TG，TG 必須通過極ow-density lipoprotein, VLDL）才能輸出肝臟，但由于反芻奶牛肝臟合成 VLDL 的速度非常慢，但合成 TG 的速度與肝臟的 TG 合成速率超過了水解或 VLDL 轉運速率時，就肝會進一步加重機體炎癥反應，進而增加機體的患病風險牛脂肪組織提供能量緩解 NEB 的同時，其代謝物也可能致一系列疾病發(fā)生概率增加，，因此，對于脂肪組織的代謝渡期奶牛疾病的預防和治療是很必要的。

并與一種小的MAF蛋白質異二聚體化，異二聚體識別ARE[143]，即存在于NFE2L2靶基因調控區(qū)的增強子序列，對關鍵轉錄因子的激活至關重要。NFE2L2可影響近500個編碼蛋白質的基因的表達，這些蛋白質包括氧化還原平衡因子、解毒酶、應激反應蛋白和代謝酶等[144]。3.2 NFE2L2 信號通路NFE2L2信號通路是細胞對抗氧化應激的重要機制之一[145]。在正常生理狀態(tài)下，NFE2L2通過與Keap1結合并錨定在細胞質中，保持抑制狀態(tài)。然而，在氧化應激狀態(tài)下，NFE2L2進入細胞核與MAF異二聚體化，并與ARE結合，隨后激活下游抗氧化基因，產(chǎn)生強大的抗氧化作用，如血紅素加氧酶-1（HMOX1）、NADH醌氧化還原酶1（NQO1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等（圖2）。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23

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