【摘要】：DEAD/H-box家族RNA解旋酶是一類重要的解旋酶,DDX21是DEAD box家族的一員,在正常細(xì)胞中主要位于細(xì)胞核的核仁中,對(duì)細(xì)胞RNA加工過(guò)程具有重要的作用。此外,DDX21被證實(shí)可能調(diào)控宿主細(xì)胞先天性免疫。在來(lái)源于骨髓的樹(shù)突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cells,mDCs)細(xì)胞中,DDX21通過(guò)作用于DDX1-DDX21-DHX36-TRIF通路來(lái)調(diào)控天然免疫。登革熱病毒感染后DDX21能夠從細(xì)胞核遷移進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答。然而,對(duì)于DDX21具體如何調(diào)控抗病毒天然免疫機(jī)制尚不可知。為了探究DDX21調(diào)控抗病毒天然免疫的新機(jī)制,我們展開(kāi)以下研究:一、DDX21調(diào)控病毒刺激所誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生。為了觀察DDX21在抗病毒免疫應(yīng)答的功能,沉默DDX21基因后感染病毒,以Western blot、TCID_(50)、ELISA和RT-PCR方法鑒定DDX21基因的缺失對(duì)病毒復(fù)制和干擾素產(chǎn)生的影響,結(jié)果表明:DDX21的沉默能夠促進(jìn)干擾素的產(chǎn)生并且抑制病毒的復(fù)制。但是DDX21的過(guò)表達(dá)對(duì)干擾素的產(chǎn)生和病毒復(fù)制沒(méi)有顯著影響。二、DDX21在病毒的作用下能夠發(fā)生切割。為了研究DDX21在病毒感染后蛋白表達(dá)的變化,用不同的細(xì)胞感染不同的病毒或使用核酸模擬物刺激細(xì)胞,以Western blot方法檢測(cè),結(jié)果表明:內(nèi)源性和外源性的DDX21在病毒感染和核酸模擬物刺激后均能夠發(fā)生切割。三、病毒感染通過(guò)Caspase-3/6途徑切割DDX21。為了探究DDX21的切割機(jī)制,首先利用抑制劑處理病毒感染的細(xì)胞。結(jié)果顯示:Caspase抑制劑z-VAD-FMK能夠顯著抑制DDX21的切割,通過(guò)構(gòu)建一系列DDX21的缺失和突變真核表達(dá)質(zhì)粒,證實(shí)DDX21 126位天冬氨酸為其切割位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)其切割位點(diǎn)序列的分析及基因敲除實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,證實(shí)Caspase-3/6參與了病毒感染誘導(dǎo)的切割DDX21切割。四、DDX21切割后能夠從細(xì)胞核遷移至細(xì)胞質(zhì)中。為了觀察DDX21在發(fā)生切割后是否影響其定位發(fā)生變化,以激光共聚焦的方法檢測(cè)病毒感染后DDX21的定位,證實(shí)DDX21在病毒感染后從細(xì)胞核遷移到細(xì)胞質(zhì)中,進(jìn)一步結(jié)果證實(shí)DDX21的轉(zhuǎn)位依賴于切割。五、DDX21切割抑制抗病毒先天性免疫通路。為了探究DDX21切割對(duì)先天性免疫通路的影響,通過(guò)比較DDX21切割與不切割對(duì)干擾素產(chǎn)生的影響,結(jié)果表明:DDX21切割抑制病毒感染和poly(I:C)誘導(dǎo)的干擾素的產(chǎn)生及下游干擾素刺激基因的表達(dá)。六、DDX21 C端結(jié)構(gòu)域結(jié)合雙鏈RNA。為了進(jìn)一步地探究DDX21的切割如何調(diào)控干擾素的產(chǎn)生,利用CO-IP和RNA pull down方法檢測(cè)DDX21與其自身和RNA的互作,結(jié)果顯示DDX21能夠通過(guò)其C端結(jié)構(gòu)域與自身和雙鏈RNA互作。本論文證明DDX21在抗病毒天然免疫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,更重要的是首次發(fā)現(xiàn)DDX21在病毒的作用下發(fā)生切割且能夠發(fā)生遷移,通過(guò)與RNA結(jié)合調(diào)控抗病毒天然免疫。這為進(jìn)一步的研究DDX21調(diào)控抗病毒天然免疫提供理論依據(jù)。
【圖文】：

Lasko et al. 1989)。研究結(jié)果表明p68、SrmB、MSS116、vasa、PL10、哺乳動(dòng)物的eIF4A、酵母eIF4A這些蛋白均參與RNA代謝并且具有相似的序列，這些序列為Q-基序、基序1、基序1a、基序1b、基序I、基序II、基序III、基序IV、基序V、基序VI（圖1-1）(Linder, Lasko et al. 1989)。其中基序II包含Walker B 基序和D-E-A-D (Asp-Glu-Ala-Asp)氨基酸序列，因而將其命名為DEADbox (Silverman, Edwalds-Gilbert et al. 2003)。Q-基序、基序1、基序II、基序IV可以結(jié)合ATP導(dǎo)致水解的發(fā)生。而基序1a、基序1b、基序III、基序IV和基序V可以發(fā)生分子內(nèi)的重排和RNA互作(Tanner,Cordin et al. 2003)。圖 1-1 DEAD box 家族的基序fig.1-1 Motifs within the DEAD Box FamilyFrom Wikimedia Commons

毒滴度近乎一致)。因此初步認(rèn)為，DDX21 基因的沉默抑制 VSV 的復(fù)制。對(duì)于 DDX21 的沉默抑制病毒復(fù)制，，可能是由于干擾素的產(chǎn)生抑制病毒的復(fù)制。為了證明這個(gè)假設(shè)，以 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞上清IFN-β的水平(圖2-1 C)，與對(duì)照組相比發(fā)現(xiàn)在感染病毒后實(shí)驗(yàn)組IFN-β的含量明顯的增多。為了驗(yàn)證上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以熒光定量 PCR 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的 IFN-β 和干擾素下游刺激因子( interferon-stimulated gene, ISG)的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果與 ELISA 一致(圖 2-1 D-F)，DDX21 的沉默促進(jìn)干擾素及干擾素下游刺激因子的產(chǎn)生。因此，得出結(jié)論 DDX21 的沉默抑制 VSV 的復(fù)制并促進(jìn)干擾素的產(chǎn)生。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.4

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊琪;趙星皓;卓少元;;Caspase-1與腫瘤相關(guān)性研究進(jìn)展[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2019年01期

2 張?jiān)娞?張達(dá);牛文彥;;肥胖患者炎性單核細(xì)胞Caspase活性的研究[J];天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2017年02期

3 李學(xué)玲;董紅芬;;血清IL-18、Caspase-3水平與新生兒缺氧缺血性腦病的相關(guān)性[J];實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志;2016年03期

4 張瀟月;孔慶宏;王冠林;張寬仁;;Procaspase-8/Caspase-8非凋亡作用的研究進(jìn)展[J];生命的化學(xué);2016年05期

5 黃巧麗;周華;李濤;;Caspase的非凋亡性作用[J];生命的化學(xué);2015年03期

6 Fatih 噻elik;Fatih Ulas;Zeynep Günes 銉zünal;Tülin F|rat;Serdal 噻elebi;

本文編號(hào)：2621871