【摘要】：抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是由生物體產(chǎn)生具有抗微生物活性的短肽,通常由6-60個(gè)氨基酸組成,呈現(xiàn)酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性,抗菌譜較廣。雜合方法是一種近年來興起的抗菌肽改造策略,將兩種或兩種以上具有不同特性的抗菌肽融合產(chǎn)生新的抗菌肽,引入不同抗菌肽的特性,定向?qū)咕倪M(jìn)行改造。因此,通過雜合方式對抗菌肽氨基酸序列進(jìn)行改造,提高抑菌活性、降低細(xì)胞毒性已成為抗菌肽研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。以本課題組發(fā)現(xiàn)的家蠅抗菌肽MDAP-2為母肽,與抗菌活性強(qiáng)的BuforinⅡ衍生肽的α-螺旋區(qū)域(3×RVVR)進(jìn)行雜合,通過生物信息學(xué)工具對雜合結(jié)果進(jìn)行分析并篩選出優(yōu)勢肽MB19(KFFTLLARVVRRVVRRVVR)。利用氨基酸替換方法設(shè)計(jì)雜合肽MB5R[MB19氨基酸序列中5號(hào)位亮氨酸(L)被精氨酸(R)替換]、MB7R[MB19氨基酸序列中的7號(hào)位丙氨酸(A)、5號(hào)位亮氨酸(L)被替精氨酸(R)替換]、MB19n(MB19的C-末端進(jìn)行酰胺化修飾),通過提高正電荷含量、降低疏水性和疏水力矩等方式提高雜合肽的抑菌活性、減小細(xì)胞毒性。利用化學(xué)方法合成上述4條雜合肽,通過體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、溶血活性實(shí)驗(yàn)和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)等篩選出抑菌活性更強(qiáng)、細(xì)胞毒性更低、穩(wěn)定性更好的的雜合肽MB7R;通過細(xì)胞外膜通透性實(shí)驗(yàn)、內(nèi)膜通透性實(shí)驗(yàn)、掃描電鏡分析、透射電鏡分析、DNA阻滯實(shí)驗(yàn)證實(shí)MB7R可以通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜與細(xì)菌DNA結(jié)合殺死細(xì)菌。在獲得抗菌活性強(qiáng)、細(xì)胞毒性低的雜合肽MB7R基礎(chǔ)上,利用同尾酶構(gòu)建MB7R多聚串聯(lián)體,增大目的基因長度。通過Bac-to-Bac系統(tǒng)轉(zhuǎn)座原理,將目的基因12MB7R插入到pFastBac中的表達(dá)框位點(diǎn)上,經(jīng)Tn7轉(zhuǎn)座子將重組的pFastBac-12MB7R插入到Bacmind的Tn7表達(dá)框位點(diǎn)上,成功構(gòu)建穿梭載體Bacmid-12MB7R。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將重組桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細(xì)胞中,成功表達(dá)了分子量約為28.38 kDa串聯(lián)蛋白體12MB7R,反復(fù)侵染獲得高滴度病毒,利用Western Blot優(yōu)化表達(dá)條件,為進(jìn)一步擴(kuò)大雜合肽MB7R制備及獸醫(yī)臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.利用雜合方法設(shè)計(jì)雜合抗菌肽,通過生物信息學(xué)分析篩選出1條優(yōu)勢肽MB19,在MB19基礎(chǔ)上利用氨基酸替換方法優(yōu)化設(shè)計(jì)3條衍生肽(MB5R、MB7R和MB19n),化學(xué)合成上述4條雜合肽,利用體外抑菌實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、溶血活性實(shí)驗(yàn)和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)等篩選出1條活性好的雜合肽MB7R。2.通過細(xì)胞外膜通透性實(shí)驗(yàn)(NPN)、內(nèi)膜通透性實(shí)驗(yàn)(ONPG)證實(shí),雜合肽MB19、MB5R、MB7R對細(xì)菌細(xì)胞膜具有破壞作用;通過掃描電鏡和透射電鏡對菌體細(xì)胞膜及內(nèi)容物進(jìn)行觀察,證實(shí)了雜合肽MB7R作用靶點(diǎn)是細(xì)菌細(xì)胞膜;DNA阻滯實(shí)驗(yàn)表明,雜合肽破壞細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)后可以與DNA作用,殺死細(xì)菌。3.成功構(gòu)建了pFast-12MB7R供體質(zhì)粒并產(chǎn)生Bacmid-12MB7R重組桿狀病毒;利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功侵染Sf9昆蟲細(xì)胞,成功表達(dá)了分子量約為28.38 kDa的串聯(lián)蛋白體12MB7R,利用Western Blot優(yōu)化侵染時(shí)間,病毒侵染Sf9細(xì)胞72h時(shí)蛋白表達(dá)量最高,通過Ni~(2+)親和層析純化獲得串聯(lián)蛋白體12MB7R。為雜合肽MB7R大量制備及獸醫(yī)臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

A BC D圖1.1 抗菌肽構(gòu)象：（A）α-螺旋型抗菌肽 （B）無規(guī)則型抗菌肽 （C）β-折疊型抗菌肽 （D）環(huán)狀結(jié)構(gòu)抗菌肽Fig.1.1 Antimicrobial peptide conformation: （A）α-helical antimicrobial peptide（B）Irregularantimicrobial peptide（C）β-foldable antimicrobial peptide（D）Ring-shaped antimicrobial peptide1.4 抗菌肽分子設(shè)計(jì)及改造現(xiàn)狀在實(shí)際的生產(chǎn)生活種，雖然已有少數(shù)的抗菌肽產(chǎn)品進(jìn)入到市場中，但多數(shù)抗菌肽因?yàn)楫a(chǎn)量低、合成成本高、穩(wěn)定性差、毒性強(qiáng)等問題，限制了其臨床應(yīng)用。因此對通過對已有抗菌肽分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造、修飾來降低其毒性、提高選擇性已成為抗菌肽研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)[13]。1.4.1 氨基酸殘基設(shè)計(jì)通過在抗菌肽肽鏈中插入帶正電荷氨基酸殘基、替換氨基酸殘基及改變親水、疏水性氨基酸比例進(jìn)行抗菌肽設(shè)計(jì)，，已成為抗菌肽分子改造的研究熱點(diǎn)。Ahn等[14]和Hawrani等[15]研究證實(shí)在?

1.3.2 雜合肽的二級結(jié)構(gòu)測定圓二色光譜用來檢測雜合肽在模擬細(xì)胞膜中親水環(huán)境和疏水環(huán)境的二級結(jié)構(gòu)。如圖 1.2 所示，雜合肽 MB19、MB5R、MB7R 在 PBS 模擬的親水環(huán)境中沒有明顯的 α-螺旋，呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。在 50%TFE 模擬的疏水環(huán)境中被誘導(dǎo)形成α-螺旋結(jié)構(gòu)（波長在208 nm和222 nm處有兩個(gè)明顯的最低峰），表示MB19、MB5R、MB7R 在疏水環(huán)境中易被誘導(dǎo)成 α-螺旋結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S859.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2621723