【摘要】：養(yǎng)殖過程的斷奶應激、嚴重的環(huán)境異常刺激或者中毒等對豬腸道健康有重要的影響,如誘發(fā)腸道氧化損傷與炎性反應,進而降低豬的生長性能,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失。因此,將低毒性、無有害殘留的天然產物分子開發(fā)為保護豬腸道的獸藥或飼料添加劑具有重要的意義。槲皮素(Quercetin,Que)是一種常見的黃酮類物質,在人與小鼠等多種模式細胞中表現(xiàn)出抗氧化、抗炎等生物活性,但是目前沒有關于其對豬腸道健康調控方面的詳盡報道。所以,本試驗擬探究Que對豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)增殖的影響,并采用過氧化氫(H_2O_2)和脂多糖(LPS)在體外建立氧化損傷和炎癥反應模型,探究Que對模型條件下豬小腸上皮細胞保護作用及其可能的機制。本研究采用紫外分光光度法確證Que含量,并采用細胞形態(tài)比對法與免疫熒光法對IPEC-J2細胞形態(tài)進行初步鑒定;以MTT法、流式細胞術、Real-time PCR檢測Que對IPEC-J2增殖的影響,并以細胞劃痕試驗檢測Que對IPEC-J2損傷修復的影響;MTT法檢測Que處理H_2O_2暴露下細胞的活力變化,2,4-二硝基苯肼法檢測細胞上清LDH活力,鏡下觀察細胞形態(tài);采用流式細胞術檢測Que處理H_2O_2暴露下細胞的凋亡率、細胞周期、胞內ROS水平和△ψm變化,Western-blot檢測凋亡相關蛋白的相對表達量;比色法檢測Que對低程度氧化損傷的細胞MDA含量與SOD、CAT活力的影響,采用Western-blot檢測Claudin-1、Occludin蛋白相對表達量;MTT法檢測Que處理LPS暴露下細胞的活力變化,鏡下觀察細胞形態(tài),Griess法檢測細胞培養(yǎng)上清NO含量,Real-time PCR檢測IL-6和IL-8的mRNA相對表達量。結果顯示:Que供試藥平均含量為97.97%,細胞形態(tài)呈圓梭形、卵圓形,與已報道的IPEC-J2細胞形態(tài)基本一致,細胞中存在CK-18蛋白表達。1.25μg/mL至5μg/mL Que在24 h內顯著提高IPEC-J2細胞活力,9 h時其促進增殖作用最明顯,5μg/mL Que作用細胞24 h可推進細胞進入S期,抑制P27和P21 mRNA的相對表達量,但不能促進細胞劃線后的損傷修復。Que預處理2 h、375μM H_2O_2暴露22 h,Que預處理20 h、750μM H_2O_2暴露4 h,Que與375μM H_2O_2共同處理24 h,Que預處理3 h、750μM H_2O_2暴露1 h、2 h與4 h,Que預處理3 h、1000μM H_2O_2暴露4h,皆能顯著提高因H_2O_2暴露而降低的IPEC-J2細胞活力;Que預處理能明顯改善750μM H_2O_2誘導的細胞形態(tài)異常變化,抑制細胞LDH的釋放。Que預處理顯著降低H_2O_2暴露后的細胞凋亡率,降低G0/G1細胞比例,升高S期與G2/M期細胞總比例,抑制ROS的產生,升高△ψm,降低Bax/Bcl-2比值。Que預處理3 h顯著降低低程度氧化損傷(750μM H_2O_2暴露2 h)后的胞內MDA含量和SOD活力,對CAT活性以及Claudin-1、Occludin蛋白相對表達量無顯著影響,但對Claudin-1、Occludin蛋白表達具有輕微的上調作用。1μg/mL至10μg/mL的LPS對IPEC-J2細胞活力無明顯影響,而Que顯著升高LPS暴露下的細胞活力;Que與LPS對IPEC-J2細胞上清中NO含量無影響,但Que可抑制LPS暴露下IL-6與IL-8的mRNA相對表達量。本試驗表明Que供試藥含量高,試驗所用細胞系屬于上皮細胞且與已報道的IPEC-J2形態(tài)基本一致。低濃度Que可以促進IPEC-J2增殖,其增殖作用與推進細胞由G1期進入S期以及抑制P21、P27基因表達有關,但不具有劃線損傷修復功能。Que在不同處理時間下均可減少H_2O_2所致的細胞死亡。Que降低H_2O_2所致的IPEC-J2細胞凋亡率與G0/G1細胞比例,抑制內源性凋亡途徑。Que能調節(jié)H_2O_2低程度損傷下細胞內氧化還原系統(tǒng),低程度損傷下細胞的屏障蛋白Claudin-1、Occludin表達無明顯變化,而Que對其可能具有潛在的上調作用。Que抑制LPS誘導下的IPEC-J2炎性反應,降低LPS誘導下的IPEC-J2促炎因子基因表達,其機制與NO途徑無關,可能與其他通路有關,具體的通路有待深入研究。因此,Que對體外的豬小腸上皮細胞增殖具有促進作用,且可緩解細胞的氧化損傷與炎性反應。
【圖文】：

湖南農業(yè)大學碩士學位論文為陰性，不會誘導小鼠骨髓細胞與精子發(fā)生突變。陳鴻雨等 (2015)對 Q行了急性毒性試驗，發(fā)現(xiàn) 6 g/kg Que 不會導致大鼠死亡，剖檢也未見明且在其亞急性毒性試驗中的血常規(guī)、血液生化指標以及組織形態(tài)學等均常。Utesch et al. (2008) 也表明 Que 在大鼠體內不會產生遺傳毒性。但) 卻通過體外試驗發(fā)現(xiàn) Que 對鼠肺成纖維細胞有致突變性。國家食品藥品 (2017) 也發(fā)布了最新的世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構致癌物清單，Q類致癌物，該類致癌物的劃分依據(jù)為“對人類致癌性可疑，但尚無充分的據(jù)”。體外試驗因缺乏動物機體完善的調節(jié)機制，因此沒有確切的動物撐，就此判定 Que 存在安全風險的證據(jù)仍然不夠充分。所以，基于現(xiàn)今評價試驗，在合理劑量范圍內，可以認為 Que 的安全性較高。

湖南農業(yè)大學碩士學位論文豬腸道除了能夠消化和吸收營養(yǎng)物質，還能進行物質代謝與免疫調節(jié)等可見其健康與生長性能密切相關。養(yǎng)殖過程的斷奶應激、嚴重的環(huán)境異常毒等對豬腸道健康影響較大，往往會誘發(fā)氧化損傷和炎性反應，輕則降低能，重則還可導致豬只死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來經濟損失。而 Que 作為植物源子含有多個羥基，，具有較好的清除自由基與抑制炎性反應的活性。但迄今在豬氧化損傷和炎癥反應上的研究鮮見，特別是關于豬小腸或其細胞層面所以，Que 對豬腸道是否具有保護作用還沒有詳盡的證據(jù)。見圖 1-2。本研究選題目的與意義
【學位授予單位】：湖南農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28

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本文編號：2621334