【摘要】：犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)和貓細小病毒(Feline parvovirus,FPV)是親緣關(guān)系密切的兩種細小病毒,都屬于細小病毒科,原細小病毒屬,肉食動物原細小病毒1型種的成員。犬細小病毒和貓細小病毒不僅能感染犬科、貓科、鼬科、浣熊科和靈貓科等多種動物,而且引起相似的臨床癥狀;是危害肉食動物健康最嚴(yán)重的烈性傳染病病原體之一;前者有多種抗原型且二者可混合感染動物,因此單憑臨床癥狀難以做出鑒別診斷,必須借助實驗室檢測手段確診。本研究經(jīng)大量CPV VP2基因序列比對,利用Beacon designer7軟件設(shè)計兩對引物和五條MGB探針。引物CPV-305F/CPV-305R和探針CPV-2-305P(CPV-2)/CPV-2a-305P(CPV-2a)用于區(qū)分CPV-2疫苗株和其它抗原型試驗;引物CPV-426F/CPV-426R和探針CPV-2-426P(CPV-2/2a)/CPV-2b-426P(CPV-2b)/CPV-2c-426P(CPV-2c)用于區(qū)分CPV-2a(2)、CPV-2b和CPV-2c抗原型試驗。通過這兩個單獨的多重TaqMan real-time PCR試驗可以有效的檢測和區(qū)分CPV-2、CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c四種抗原型CPV。該檢測方法可檢測10~1個拷貝的CPV-2,CPV-2a和CPV-2b重組質(zhì)粒,10~2個拷貝的CPV-2c重組質(zhì)粒;特異性試驗表明本方法適合于CPV的檢測,而和犬瘟熱病毒、犬腺病毒和冠狀病毒等均無交叉反應(yīng)性;本方法經(jīng)臨床初步應(yīng)用,并與PCR測序方法檢測結(jié)果進行對比,顯示兩者檢測結(jié)果符合率為100%。結(jié)果表明本研究成功建立了一種多重TaqMan real-time PCR檢測方法,該方法能夠用于檢測和區(qū)分CPV四個抗原型,并可定量測定CPV DNA。本研究利用qPCR-HRM試驗分析可檢測單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)和序列堿基組成變化的優(yōu)勢,依據(jù)FPV和CPV的SNP A4408C位點,設(shè)計一對引物,進化qPCR擴增;擴增完成后的數(shù)據(jù)用Applied Biosystems?High Resolution Melt Software v3.1軟件自動分析;結(jié)果表明該方法能同時檢測感染動物糞便中的CPV或FPV DNA。特異性試驗表明本方法和犬瘟熱病毒,犬腺病毒和犬冠狀病毒等無交叉反應(yīng);敏感性試驗表明該方法最低可以檢測到4.2個拷貝的CPV和FPV的重組質(zhì)粒;為評估本方法的可行性,80個疑似細小病毒感染臨床樣品用于該方法和PCR-測序以及病毒分離等試驗的平行分析,結(jié)果證明,該方法和基因測序以及病毒分離等方法符合率高,其符合率分別是96.25%和85%。本研究成功建立了一種能夠同時檢測和區(qū)分CPV和FPV的診斷方法。
【圖文】：

農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第氨酸突變?yōu)榻z氨酸或天冬氨酸后，則失去了與 CPV 和 FPV 結(jié)合的能力，將該位，則失去與 FPV 結(jié)合的能力。病毒進入細胞內(nèi)，，形成核包體，從核包體中釋放進入到細胞質(zhì)中。細小病毒粒子為 25nm，因此細小病毒可依靠其衣殼蛋白上存在的核內(nèi)定位信號，使得病毒粒入細胞核內(nèi)（Harbisonetal.,2008）。研究報道，病毒進入核孔的過程中，由于內(nèi)體的結(jié)構(gòu)會發(fā)生一些可逆變化（Farr et al., 2005）。病毒進入核內(nèi)后，在宿主的 DNA 復(fù)制酶發(fā)揮作用下，以 3’端-OH 基因團作為復(fù)堿基配對的原則，將其基因組的單股 DNA 復(fù)制成雙股 DNA。宿主的 RNA 聚合病毒基因則開始轉(zhuǎn)錄為 mRNA。mRNA 經(jīng)可變剪切作用，產(chǎn)生了兩類不同長度的 mRNA 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，較短的編碼結(jié)構(gòu)蛋白。最后，病毒的組裝要先形成前體需要多個結(jié)構(gòu)蛋白組建在一起。然后在非結(jié)構(gòu)蛋白的作用下，使雙鏈 DNA 變成單鏈 DNA 進入到前體衣殼中，最終病毒組裝形成完整的病毒粒子被釋放。

V LN15-32；2：CPV JL14-1；3：CPV BJ14-1；4：CPV B 2.1 CPV VP2 基因 PCR 擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果el electrophoresis result of amplification of CPV V，對挑取的菌落進行 PCR 和測序鑒定，同時表明成功構(gòu)建了用于 TaqMan real-time P為 pCPV LN15-32，pCPV JL14-1，pCP LN15-32；2：pCPV JL14-1；3：pCPV BJ14-1；4：pCPV圖 2.2. 重組質(zhì)粒菌落 PCR-電泳鑒定圖
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

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本文編號：2620274