發(fā)布時間：2020-04-09 03:16

【摘要】：硒是發(fā)揮著重要生物學(xué)功能的一種關(guān)鍵的微量元素。日糧中缺乏硒可造成雞多種器官中發(fā)生一系列的臨床和病理改變。與其它組織相比較,腎臟的硒含量較高,腎臟也是硒缺乏的靶器官之一,硒缺乏能夠引起雞腎功能衰退、氧化應(yīng)激和腎纖維化,此外還影響細(xì)胞周期進(jìn)程以及引起細(xì)胞凋亡,而硒補充則會緩解這些癥狀。有研究表明miRNAs也參與腎臟的許多疾病的發(fā)生,miR-33是高度保守的miRNA家族,它在許多疾病方面發(fā)揮著重要作用,其中也包括細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡,然而目前關(guān)于miR-33在缺硒肉雞腎臟細(xì)胞凋亡中的作用還不清楚。為探討miR-33-3p及其相應(yīng)的靶基因在缺硒腎臟細(xì)胞周期及凋亡中的作用,本研究通過復(fù)制缺硒雞模型,應(yīng)用超微結(jié)構(gòu)觀察、實時熒光定量PCR技術(shù)、雙熒光素酶報告基因、AO-EB等技術(shù),檢測了缺硒腎臟中β-catenin通路的一些相關(guān)基因(E-cadherin、β-catenin、cyclinD1、TCF、c-myc、survivin)及凋亡相關(guān)基因(Bcl-2、Bax、Bak、Caspase3)和去整合素域和金屬蛋白酶域蛋白10(ADAM10)mRNA和蛋白的表達(dá)水平以及miR-33-3p的表達(dá)水平。在建立體外miR-33-3p過表達(dá)和敲低的雞胚原代腎細(xì)胞模型基礎(chǔ)上,預(yù)測并驗證了miR-33-3p的靶基因是ADAM10,通過敲低和過表達(dá)體外培養(yǎng)的雞胚原代腎細(xì)胞中的miR-33-3p,檢測腎臟β-catenin通路相關(guān)基因及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。試驗結(jié)果如下:(1)在建立體外培養(yǎng)雞胚原代腎細(xì)胞細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,成功構(gòu)建了miR-33-3p過表達(dá)和敲低模型,過表達(dá)效率為46倍,敲低效率是0.45倍。利用生物信息學(xué)預(yù)測軟件TargetScan和miRDB預(yù)測了miR-33-3p可以與ADAM10基因的3’UTR片段結(jié)合,表明ADAM10可能是miR-33-3p的一個靶基因。另外,通過構(gòu)建雙熒光素酶報告基因、RT-PCR和western blot的方法確認(rèn)了ADAM10是miR-33-3p的靶基因之一。(2)低硒飼料能夠引起雞腎臟組織中miR-33-3p表達(dá)上調(diào)和ADAM10表達(dá)下調(diào),miR-33-3p上調(diào)9倍,ADAM10表達(dá)下調(diào)46%,并且引起E-cadherin表達(dá)上調(diào),而β-catenin、cyclinD1、TCF、c-myc、survivin表達(dá)下調(diào),促凋亡基因Bak、Bax和Caspase3表達(dá)上調(diào),相反的,抑凋亡基因Bcl-2表達(dá)下調(diào),同時超微組織結(jié)構(gòu)觀察的結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺硒中腎臟細(xì)胞凋亡率顯著增多。上述結(jié)果表明,miR-33-3p及其靶基因ADAM10與低硒引起腎臟細(xì)胞凋亡相關(guān)。(3)為了確認(rèn)miR-33-3p對雞胚原代腎細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡的影響,我們建立了雞原代體外培養(yǎng)腎臟細(xì)胞miR-33-3p過表達(dá)和敲低模型,結(jié)果表明雞胚原代腎細(xì)胞過表達(dá)miR-33-3p時,細(xì)胞周期相關(guān)基因(β-catenin、cyclinD1、TCF、c-myc、survivin)表達(dá)下調(diào),細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bak、Bax和Caspase3表達(dá)水平上調(diào),而Bcl-2則下調(diào),同時通過流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染miR-33-3p mimic之后細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-33-3p mimic后細(xì)胞周期阻滯,在G0/G1期細(xì)胞數(shù)量明顯增加,細(xì)胞凋亡率也明顯增加,而在雞胚原代腎細(xì)胞中敲低miR-33-3p后,細(xì)胞中細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)生變化,細(xì)胞周期相關(guān)基因(β-catenin、cyclinD1、TCF、c-myc、survivin)表達(dá)上調(diào),細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bak、Bax和Caspase3表達(dá)水平下調(diào),而Bcl-2則上調(diào),并且轉(zhuǎn)染miR-33-3p inhibitor后則流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果也表明細(xì)胞周期進(jìn)程順利進(jìn)行且細(xì)胞凋亡率明顯下降。最后我們通過AO-EB方法也證明在雞胚原代腎細(xì)胞中過表達(dá)miR-33-3p會增加細(xì)胞凋亡率,而抑制細(xì)胞中的miR-33-3p水平則會降低細(xì)胞凋亡率。這些結(jié)果表明miR-33-3p能夠通過抑制ADAM10表達(dá)引起雞胚原代腎細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡。綜上所述,低硒日糧能夠引起miR-33-3p表達(dá)上調(diào),并通過負(fù)調(diào)控靶基因ADAM10,進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡。本試驗為探索miRNA與硒缺乏之間的相互作用機制奠定了基礎(chǔ),并為防治缺硒性腎臟損傷機制提供理論依據(jù)。
【圖文】：

實驗路線圖

ADAM10 3’UTR 單鏈寡核苷酸進(jìn)行退火，由此 μL（100 μM），加入 48 μL 無菌水于 EP 管中用。膠電泳及膠回收純化進(jìn)行電泳及膠回收純化。將退火后的產(chǎn)物進(jìn)行核酸按照膠回收試劑盒說明書進(jìn)行相應(yīng)條帶的回收與純的構(gòu)建體進(jìn)行酶切、純化，，表達(dá)載體名稱為 pMIR-REP
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 盛鵬飛;硒蛋白W與低硒致雞腦損傷的相關(guān)性研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 姚海東;硒蛋白W抗氧化功能及其在雞缺硒性骨骼肌細(xì)胞凋亡作用中的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

2 蔣志惠;硒蛋白W對雞肝臟細(xì)胞凋亡影響的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號：2620212