【摘要】：豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起豬支氣管肺炎的主要病原,Mhp感染死亡率不高,但感染后定殖到呼吸道纖毛組織,破壞纖毛屏障,易引起多種疾病混合感染,給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)極大危害。Mhp結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,但培養(yǎng)環(huán)境相對(duì)較為苛刻,難以分離培養(yǎng),對(duì)其深入研究帶來(lái)極大困難。開(kāi)展有關(guān)豬肺炎支原體代謝的相關(guān)研究有助于我們更好的了解其生長(zhǎng)機(jī)制。硫辛酸(Lipoic acid,LA)是高效抗氧化劑,廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中,在有機(jī)體的能量代謝過(guò)程中起著重要作用。LA是生物體能量代謝過(guò)程中多種多酶復(fù)合物的輔酶,包括α-酮戊二酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶以及甘氨酸裂解系統(tǒng),這些多酶復(fù)合物在生物體能量代謝、脂肪酸合成以及氨基酸降解中發(fā)揮重要作用。生物體中LA的代謝主要是在相關(guān)酶的的催化作用下,以共價(jià)鍵方式連接到一類含有硫辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Lipol Domain,LD)的蛋白分子上,該過(guò)程又稱為硫辛酸修飾。硫辛酸修飾對(duì)于微生物的生長(zhǎng)代謝至關(guān)重要,但僅少數(shù)微生物的硫辛酸修飾途徑研究較為透徹,對(duì)一些物種的研究發(fā)現(xiàn)其硫辛酸蛋白連接酶在生物體硫辛酸代謝中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于豬肺炎支原體硫辛酸蛋白連接酶(Lipoate Protein Ligase,Lpl)的研究還沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為了分析Mhp中是否存在天然的Lpl,本研究制備了抗Mhp rLpl的多克隆抗體。用制備的多克隆抗體在蛋白質(zhì)水平檢測(cè)到Mhp中存在天然的Lpl。然后通過(guò)體外反應(yīng)進(jìn)行Lpl的功能研究,Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Mhp Lpl能夠?qū)⒘蛐了岱肿愚D(zhuǎn)移至Mhp GcvH上的LD上。進(jìn)一步對(duì)Mhp Lpl的結(jié)構(gòu)功能探究,結(jié)合rLpl蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析對(duì)Mhp Lpl的大小域分別進(jìn)行克隆表達(dá),并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)確定其大域能夠完成硫辛酸轉(zhuǎn)移過(guò)程,小域在硫辛酸催化反應(yīng)中不能完成硫辛酸轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步探究Lpl轉(zhuǎn)移硫辛酸至Mhp GcvH上的硫辛酸結(jié)合位點(diǎn),本研究利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)其GcvH上的賴氨酸進(jìn)行單點(diǎn)突變,將突變成功的重組質(zhì)粒表達(dá)純化后分別進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示第56位賴氨酸為硫辛酸結(jié)合位點(diǎn)。綜上,本研究首次發(fā)現(xiàn)了Mhp上存在Lpl,確定了Mhp Lpl能夠完成LA代謝反應(yīng),證明了Mhp Lpl大域和小域的功能,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了Mhp Lpl轉(zhuǎn)移硫辛酸至GcvH的第56位賴氨酸。本研究有助于我們更好的理解Mhp的生長(zhǎng)特性及代謝機(jī)制,為Mhp硫辛酸代謝相關(guān)酶的研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

有關(guān)枯草芽孢桿菌、單核增生李斯特菌、肺炎鏈球菌、嗜酸性熱源菌、天藍(lán)色鏈霉菌、牛等的硫辛酸代謝機(jī)制的研究也有文獻(xiàn)報(bào)道，但尚未完全闡明(Cao and Cronan, 2015; Keeney, 2009)。圖1.1 大腸桿菌硫辛酸代謝途徑Fig.1.1 Lipoic acid metabolism pathways in E.coliA. 外源性LA代謝：硫辛酸在LplA的作用下活化成lipoyl-AMP，活化后的lipoyl-AMP在LplA的作用下將硫辛酰部分轉(zhuǎn)移到LD上；B. 內(nèi)源性LA代謝：LipB將Oct-ACP的辛酰部分直接轉(zhuǎn)移到E2的LD上，然后在LipA的作用下迅速插入兩個(gè)硫原子完成硫辛酸內(nèi)源性代謝反應(yīng)生成硫辛酰基A. Metabolism of LAprovided in the environment：LAis activated to lipoyl-AMP by LplA，LplAthen transfers thelipoyl moiety on the activated lipoyl-AMP to the LD；B. Metabolism of Endogenous LA：LipB transfers the octanoyl moiety on the octanoyl-ACP to the LD, then LipAcatalyzes two sulfur atoms to insert into the octanoylated domains

圖 2.1 a.Mhp lpl 同已知的不同物種硫辛酸蛋白連接酶相似性分析 b.Mhp 168 基因組中 lpl 基因定位Fig. 2.1 a.Homology analysis of Mhp lpl with lipoate protein ligase from other species b.The gene of lpl mappinthe Mhp 168 genome2.3.2 Mhp lpl 基因的克隆與鑒定2.3.2.1 lpl 基因的克隆以 lpl-1F、lpl-1R 為引物，Mhp 的基因組為模板，，通過(guò) PCR 的方法擴(kuò)增出 Mhp lpl 的基因段，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小為 1029 bp，同預(yù)期結(jié)果一致（圖 2.2）。圖 2.2 lpl 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2.2Amplification of lpl by PCRM：DL2000 DNAMarker；1：lpl 基因的 PCR 產(chǎn)物M 12000bp1000bp750bp500bp250bp100bp
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.62

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本文編號(hào)：2616182