【摘要】：自噬是一種調(diào)控細(xì)胞能量代謝平衡的過程。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí),胞漿中的吞噬泡擴(kuò)張后將需要降解的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器包裹形成自噬小體。自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體,溶酶體中的蛋白水解酶和過氧化物酶降解自噬小體內(nèi)的包容質(zhì)。自噬的一個(gè)標(biāo)志性變化是胞漿中LC3-I與PE(磷脂酰乙醇胺)結(jié)合形成LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ的表達(dá)量與自噬水平呈正相關(guān)。mTOR和AMPK是感受胞漿內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和能量水平的重用激酶。前者磷酸化ULK1的S757位點(diǎn)抑制其活性以及自噬,后者磷酸化ULK1的S555位點(diǎn),誘導(dǎo)自噬。鼠傷寒沙門菌是一種革蘭氏陰性兼性胞內(nèi)寄生菌。該菌進(jìn)入宿主細(xì)胞后,形成含沙門菌的囊泡(SCV),細(xì)菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)釋放效應(yīng)蛋白導(dǎo)致囊泡破損。沙門菌突破囊泡進(jìn)入胞漿后激活選擇性自噬。然而,沙門菌可通過激活mTOR和降解AMPK逃避自噬發(fā)生。由于大部分抗生素難以進(jìn)入胞漿殺死胞內(nèi)菌,通過自噬激活劑調(diào)控自噬殺死胞內(nèi)菌是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。來(lái)氟米特是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抗炎藥。其活性代謝產(chǎn)物A771726能抑制嘧啶核苷酸合成,抑制蛋白酪氨酸激酶和S6K1激酶活性。本實(shí)驗(yàn)室近期研究發(fā)現(xiàn),A77 1726通過抑制mTOR下游的S6K1激活A(yù)MPK,磷酸化ULK1并誘導(dǎo)自噬。本研究旨在探討A77 1726是否可通過激活自噬,抑制鼠傷寒腸炎沙門菌胞內(nèi)增殖。小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系和人HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞系經(jīng)A77 1726處理后,Western blot分析自噬相關(guān)蛋白和自噬通路中的蛋白激酶磷酸化水平。結(jié)果顯示,A77 1726呈時(shí)間和劑量依賴性增加LC3-Ⅱ的表達(dá)量,反饋激活PI-3激酶信號(hào)通路,上調(diào)AMPKT172、ULK1S757和ULK1S555的磷酸化水平。熒光共聚焦顯微鏡顯示,A77 1726顯著增加RAW264.7和HeLa細(xì)胞中的自噬小體和自噬溶酶體數(shù)量。我們進(jìn)一步研究了 A77 1726是否能增強(qiáng)鼠傷寒沙門菌感染細(xì)胞的自噬。結(jié)果顯示,A77 1726處理沙門菌感染的RAW264.7細(xì)胞,LC3-Ⅱ表達(dá)量以及AMPKT172和ULK1S555的磷酸化水平顯著高于經(jīng)沙門菌或A77 1726單獨(dú)處理的細(xì)胞。熒光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn),經(jīng)沙門菌感染和A77 1726共處理的細(xì)胞中,自噬小體和自噬溶酶體顯著高于經(jīng)沙門菌或A771726單獨(dú)處理的細(xì)胞。這些結(jié)果表明,A77 1726可以促進(jìn)沙門菌誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。最后,我們研究了 A77 1726誘導(dǎo)的自噬是否影響鼠傷寒沙門菌的胞內(nèi)增殖。菌落形成試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),A77 1726處理RAW264.7細(xì)胞后顯著減少了細(xì)胞內(nèi)的沙門菌數(shù)。熒光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn),A77 1726顯著減少RAW264.7細(xì)胞中帶紅色熒光標(biāo)記的沙門菌的數(shù)量。A771726不影響LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的沙門菌生長(zhǎng)增殖。綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn)A77 1726通過抑制S61K1激酶活性,激活A(yù)MPK和ULK1并誘導(dǎo)RAW264.7和HeLa細(xì)胞自噬。A77 1726通過促進(jìn)沙門菌感染的RAW264.7細(xì)胞中的AMPK和ULK1的磷酸化水平進(jìn)一步提高細(xì)胞自噬水平。A77 1726能有效抑制沙門菌在巨噬細(xì)胞中的胞內(nèi)增殖。這些結(jié)果表明,A77 1726作為自噬激活劑能抑制胞內(nèi)菌增殖,進(jìn)一步體內(nèi)驗(yàn)證其藥效后有望開發(fā)為一種新型的抗菌藥物。
【圖文】：

通過比較ＬＣ３－ＩＩ／ｐ－ａｃｔｉｎ值的變化，能間接反映出自噬活性的強(qiáng)弱。ｐ６２作為自逡逑噬的標(biāo)志性底物，雖然將ｐ６２水平降低作為細(xì)胞發(fā)生自噬的輔助標(biāo)志，但自嗤水平進(jìn)行評(píng)逡逑估通常需要ｐ６２與其他標(biāo)志性蛋白例如ＬＣ３聯(lián)合評(píng)估作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。如圖１－１所示，與對(duì)逡逑照相比，在Ａ７７邋１７２６、Ｒａｐａ和ＰＦ－４７０８６７１處理的ＲＡＷ２６４．７、ＨｅＬａ細(xì)胞中，均能引起逡逑ＬＣ３ＩＩ表達(dá)水平增加，且Ａ７７邋１７２６這種誘導(dǎo)作用水平與作用時(shí)間和劑量呈正相關(guān)，在逡逑ＲＡＷ２６４．７、ＨｅＬａ細(xì)胞上ｐ６２水平隨時(shí)間梯度呈先增加后減少再增加趨勢(shì)，但ｐ６２在濃度逡逑梯度上沒有顯著性的變化。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑ｉ７７邋ｏｋ；邋／ｎｉｉ＼邐２邐口邋ＬＣａｉｍ邋－ａｄｗｎ逡逑Ａ７７邋１７２６邋（ｍＭ）邐——■＿，，邐ｅａ邋ｐ６２／ｐ＾0ｎ邐？逡逑０邐５０邐１００邐２００邋Ｒａｐａ邋ＰＦ邐ｆ邋１．５－邐？邐Ｔ逡逑Ｉ邐＾邐Ｐ／逡逑ＬＣ３－ｎ邐ｍｍ邋ｍｍ邋ｍｍ邋ｍｕｍ邋％邋＇邐＾邐杉逡逑…＂ｉ：：：：：：：邋－：：＝＝４邋ｉ0ｓ．邋ｎ邐勿邋＾邋？邋Ｉ逡逑Ｐ６２邐一．．．．．邋＿ｉｐ邋Ｋ邐＿邋岕多邋＿邋d剩義希粒悖簦椋鑠危恚

本文編號(hào)：2615700