【摘要】：細(xì)胞分裂周期蛋白10(cell divison cycle 10,CDC10又名SEPT7)是septins家族成員,septins是一種高度保守的GTP結(jié)合以及膜相互作用蛋白,參與許多細(xì)胞發(fā)生過(guò)程,包括細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、胞質(zhì)分裂和膜動(dòng)力學(xué)。CDC10基因普遍存在于多個(gè)肉牛品種生長(zhǎng)性狀相關(guān)數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus,QTL)上,并且該基因的表達(dá)量與肉牛生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。在CDC10基因啟動(dòng)子上游323bp處存在的GC單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(single nucleotide polymorphism,SNP)與日本黑毛和牛生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān),但該位點(diǎn)如何調(diào)控CDC10基因表達(dá)進(jìn)而影響肌肉生長(zhǎng)的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)PCR-RFLP、RNAi、細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡和雙熒光報(bào)告系統(tǒng)等技術(shù),首先檢測(cè)CDC10基因位點(diǎn)在多個(gè)牛品種群體中的突變頻率和該基因在不同組織器官的表達(dá)情況;然后構(gòu)建CDC10基因的干擾以及過(guò)表達(dá)載體,通過(guò)干擾和過(guò)表達(dá)CDC10基因表達(dá)后,檢測(cè)牛成肌細(xì)胞增殖的變化;再利用雙熒光素酶檢測(cè)G和C等位基因?qū)DC10啟動(dòng)子活性的影響。另外,通過(guò)干擾,過(guò)表達(dá)、雙熒光素酶系統(tǒng)及細(xì)胞增殖檢測(cè)等技術(shù),初步分析了與該SNP相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因ELK1對(duì)CDC10基因表達(dá)及對(duì)成肌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果如下:1)CDC10基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示,CDC10基因在成年西門塔爾牛的背部皮下脂肪、肺部和睪丸中的表達(dá)量明顯高于其它組織。2)WST1細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示,干擾和過(guò)表達(dá)CDC10后,發(fā)現(xiàn)成肌細(xì)胞的增殖速度明顯變化(P0.05);3)EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示,干擾CDC10后,成肌細(xì)胞增殖能力變化趨于顯著(P=0.52),過(guò)表達(dá)CDC10后,成肌細(xì)胞增殖能力顯著提高(P0.05);4)雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示,C等位基因的啟動(dòng)子活性顯著高于G等位基因(P0.01);5)Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示,干擾ELK1后CDC10的表達(dá)量下調(diào),而過(guò)表達(dá)ELK1后CDC10顯著上調(diào)(P0.01);6)WST1細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示,當(dāng)干擾和過(guò)表達(dá)ELK1后成肌細(xì)胞增殖速度差異不顯著(P0.05);7)EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示,當(dāng)干擾ELK1后成肌細(xì)胞增殖能力顯著降低(P0.05),過(guò)表達(dá)ELK1后成肌細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化(P0.05);8)雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示,當(dāng)在野生型G和突變型C啟動(dòng)子片段中共轉(zhuǎn)了ELK1表達(dá)載體,野生型G的啟動(dòng)子活性顯著下降(P0.01)。結(jié)果表明,CDC10基因顯著影響牛成肌細(xì)胞的增殖速度,但ELK1與CDC10-323GC SNP位點(diǎn)作用對(duì)成肌細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響,其他轉(zhuǎn)錄因子與該位點(diǎn)作用是否會(huì)影響成肌細(xì)胞的增殖,尚有待進(jìn)一步研究。
【圖文】：

SEPT3，，SEPT6和SEPT7）[65][66]（圖1.1）。Septins是進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)[67]。所有已知的septins（30-65 kDa）具有共同的結(jié)構(gòu)（圖1.2）：一個(gè)高度保守的中央GTP結(jié)合區(qū)，一個(gè)可變的氨基末端和構(gòu)成螺旋coiled-coil結(jié)構(gòu)的羧基末端，參與介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[68]。Septins可以組裝轉(zhuǎn)化成包含兩個(gè)或更多個(gè)亞基的多聚體復(fù)合物[69-71]。研究表明septin 蛋白是繼微管蛋白、微絲蛋白和中間纖維蛋白之后第4種細(xì)胞骨架成分，并在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞分裂細(xì)胞周期調(diào)控與凋亡等生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[72][73]。因此，septin功能障礙與多

圖 1.3 CDC10 表達(dá)水平與生長(zhǎng)性狀之間的關(guān)聯(lián)性分析[82]ciation analyses between CDC10 expression levels and growth注：CWT：胴體重；REA：肋部眼肌面積；RT：肋部厚度Note: CWT: carcass weight; REA: rib eye area;RT: rib thickness SNP 位點(diǎn)對(duì) CDC10 表達(dá)和肉牛肌肉生長(zhǎng)的影響C SNP 位點(diǎn)是調(diào)控 CDC10 表達(dá)和影響肉牛肌肉生長(zhǎng)等對(duì)比日本黑毛和牛和荷斯坦奶牛 CDC10 基因啟動(dòng)突變位點(diǎn)。其中存在于 CDC10 基因啟動(dòng)子上游 32 和 CC 在骨骼肌中的表達(dá)量由 GG、GC 至 CC 基因聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase c
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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10 吳語(yǔ)寧;叢凡m

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