發(fā)布時(shí)間：2020-04-03 01:27

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種常見的重要病原菌,能夠引起人的表皮感染、敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎及膿毒性關(guān)節(jié)炎等,給人類健康造成嚴(yán)重威脅。S.aureus也能引起動(dòng)物感染,如雞的皮膚膿皰,牛、羊的急慢性乳房炎,豬的流產(chǎn)、皮炎等,給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于S.aureus耐藥菌株大量增加,對(duì)S.aureus感染采用抗生素治療的效果越來越不理想。因而,免疫治療和免疫預(yù)防成為人們防治S.aureus感染的重要手段。研究發(fā)現(xiàn),S.aureus表面保守的具有較高GAPDH活性和轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合活性的表面蛋白GapC具有良好的免疫原性,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的體液免疫保護(hù)作用,可作為疫苗的候選抗原。但到目前為止,S.aureus GapC蛋白誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的B細(xì)胞表位尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已發(fā)表的S.aureus GapC基因序列設(shè)計(jì)引物,通過PCR方法擴(kuò)增出GapC基因,與pET32a(+)質(zhì)粒連接,表達(dá)重組蛋白GapC。以純化的rGap C蛋白制成免疫原,肌肉接種6-8周齡的雌性BALB/c小鼠。通過雜交瘤技術(shù)及有限稀釋法篩選出2株穩(wěn)定分泌抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株1F4和2A9,隨后對(duì)單克隆抗體(mAbs)的亞類、特異性以及對(duì)GAPDH酶活性的影響進(jìn)行了鑒定,并做了被動(dòng)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)2株mAbs均為IgG1型,且能夠與S.aureus的rGap C特異性結(jié)合,2株mAbs均能夠抑rGapC蛋白的活性。用2株mAbs被動(dòng)免疫小鼠后以S.aureus株攻毒,結(jié)果攻毒前靜脈注射mAbs的小鼠存活時(shí)間比對(duì)照組延長(zhǎng)。利用噬菌體展示技術(shù)對(duì)GapC蛋白B細(xì)胞表位進(jìn)行淘選,用夾心ELISA方法篩選親和力高的陽性克隆并進(jìn)行DNA測(cè)序。經(jīng)過序列分析,獲得了2個(gè)分別與mAb2A9和mAb1F4親和力高的表位~(236)PVATGSLT~(243)和~(272)GYTEDEIV~(279)。人工合成表位基因進(jìn)行原核表達(dá),并用mAbs對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blotting分析,其反應(yīng)性良好。將表位序列的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變,確定了構(gòu)成2個(gè)表位的關(guān)鍵氨基酸分別是P~(236)、G~(240)、L~(242)、T~(243)和G~(272)、D~(276)、E~(277)、I~(278)、V~(279);進(jìn)一步采用間接免疫熒光試驗(yàn)證明2個(gè)表位均暴露在菌體表面;用表位免疫接種小鼠的血清進(jìn)行調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn),血清能夠明顯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力;用表位免疫接種小鼠后攻毒,兩個(gè)表位均能對(duì)免疫小鼠提供良好的免疫保護(hù)。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究表位疫苗提供參考。
【圖文】：

組質(zhì)粒 pMD18-T-gapC 的雙酶切及 PCRe recombinant pMD18-T-gapC plasmid by and PCR analysisAMarker; 1: pMD18T-gapC 經(jīng) BamHI 和2: PCR 擴(kuò)增 gapC 基因. 重組質(zhì)粒的鑒定D18-T-gapC 重組質(zhì)粒和 pET-32a(+收 pMD18-T-gapC 的目的片段和質(zhì)桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，，挑1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示獲得的因測(cè)序結(jié)果與 NCBI 序列同源性為

組質(zhì)粒 pET-32a(+)-gapC 的雙酶切及 PCR 鑒of the recombinant pET-32a(+)-gapC plasmid bydigestion and PCR analysis ladder; 1: pET-32a(+)-gapC 經(jīng) BamHI 和 Hind2: PCR 擴(kuò)增 gapC 基因. Western blotting 鑒定行 SDS-PAGE，蛋白條帶大小與預(yù)期結(jié)并且通過 His-binding-resin 純化柱純化estern blotting進(jìn)一步證實(shí)了重組GapC
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.611

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 朱自強(qiáng);;金黃色葡萄球菌更具殺傷力的原因在于其金黃色“外殼”[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2005年11期

2 朱風(fēng)蘭,王海濤,田長(zhǎng)星,過祥豹,汪美先;金黃色葡萄球菌A蛋白的提取及其影響因素的初步探討[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1983年02期

3 秘學(xué)文;來則民;郭素賢;劉景英;;金黃色葡萄球菌A蛋白的制備和鑒定[J];天津醫(yī)藥;1983年06期

4 何敏,白京榮;一株L型金黃色葡萄球菌的返祖與鑒定[J];蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1997年03期

5 韓景田,李浴峰,葉路,宋月英,買霞;驅(qū)蚊露誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌L型形成的實(shí)驗(yàn)觀察[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2000年19期

6 李向陽,于靜濤,丁吉宗;溫度對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌代謝過程的規(guī)律研究[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2001年05期

7 邢建明,周豐寧,張u&;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)金黃色葡萄球菌[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2005年08期

8 周勤華;;金黃色葡萄球菌A蛋白基因的克隆、表達(dá)和純化[J];嘉興學(xué)院學(xué)報(bào);2007年03期

9 范一靈;潘峰;史賢明;;金黃色葡萄球菌分子檢測(cè)技術(shù)的常用靶基因[J];微生物學(xué)雜志;2008年03期

10 胡娜;肖夏;杜斌斌;熊亞利;徐玲;;金黃色葡萄球菌蛋白A基因的克隆[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年25期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 單璐;童宇峰;馮銀鋼;王金鳳;;金黃色葡萄球菌核酸酶無脯氨酸突變體的溶液結(jié)構(gòu)及骨架動(dòng)態(tài)特性研究[A];第十三屆全國(guó)波譜學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2004年

2 王良興;;金黃色葡萄球菌致病性研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[A];2011年第三十三屆浙江省呼吸系病學(xué)術(shù)年會(huì)暨呼吸疾病診治新進(jìn)展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2011年

3 唐吉思;吳金花;布日額;張海寶;薛曉陽;劉洋;;內(nèi)蒙古牛乳中產(chǎn)腸毒素A型金黃色葡萄球菌的分離與鑒定[A];第3屆全國(guó)人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

4 梁景濤;謝翊;林秋芬;盧振林;陳淑玲;;三種食品中金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法的比較研究[A];2010廣東省預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)資料匯編[C];2010年

5 索玉娟;于宏偉;凌巍;賈英民;;食品中金黃色葡萄球菌污染狀況研究[A];中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)第五屆年會(huì)暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

6 楊玉書;;135株金黃色葡萄球菌耐藥率分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

7 邵東華;邱亞峰;沈陽;史子學(xué);馬志永;;金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)第二次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

8 王敏;單璐;王金鳳;;金黃色葡萄球菌核酸酶C-端缺失片段溶液構(gòu)象的多維核磁共振研究[A];中國(guó)科協(xié)2005年學(xué)術(shù)年會(huì)生物物理與重大疾病分會(huì)論文摘要集[C];2005年

9 朱戰(zhàn)波;任憲剛;崔玉東;樸范澤;;金黃色葡萄球菌的分子生物學(xué)分型研究進(jìn)展[A];第四屆第九次全國(guó)學(xué)術(shù)研討會(huì)暨飼料和動(dòng)物源食品安全戰(zhàn)略論壇論文集（下冊(cè)）[C];2008年

10 章惠彬;葛主輝;;嬰兒下呼吸道感染金黃色葡萄球菌145例臨床分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三屆全國(guó)兒科呼吸學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 王小龍;夏秋兩季易感染金黃色葡萄球菌[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

2 國(guó)家二級(jí)營(yíng)養(yǎng)師 李純;警惕牛奶中的金黃色葡萄球菌[N];健康報(bào);2012年

3 本報(bào)記者 閆巍;《速凍》新國(guó)標(biāo)將實(shí)施專家稱已與世界接軌[N];糧油市場(chǎng)報(bào);2011年

4 記者 桂運(yùn)安;金黃色葡萄球菌入侵細(xì)胞新機(jī)制[N];安徽日?qǐng)?bào);2014年

5 記者 馬曉華;水餃新國(guó)標(biāo)再起爭(zhēng)議 衛(wèi)生部稱不影響食品安全[N];第一財(cái)經(jīng)日?qǐng)?bào);2011年

6 記者 白毅;金黃色葡萄球菌感染宿主“幫兇”被找到[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2014年

7 侯震;金黃色葡萄球菌致中毒[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2000年

8 北京大學(xué)臨床藥理研究所 衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng) 王進(jìn);金黃色葡萄球菌在蔓延[N];健康報(bào);2008年

9 本報(bào)記者 徐建華;“限量檢出”更符合實(shí)際[N];中國(guó)質(zhì)量報(bào);2011年

10 本報(bào)記者 郭朝飛;應(yīng)對(duì)“細(xì)菌門”思念、三全業(yè)績(jī)表現(xiàn)迥異[N];中國(guó)經(jīng)濟(jì)時(shí)報(bào);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王營(yíng);金黃色葡萄球菌及其腸毒素基因分布的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 齊偉;應(yīng)用分子生物學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)快速鑒定金黃色葡萄球菌[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2011年

3 凌巍;金黃色葡萄球菌的分布及其腸毒素基因的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

4 索玉娟;食品中金黃色葡萄球菌的分布及其腸毒素基因的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

5 黃丹;乳源性金黃色葡萄球菌耐藥及產(chǎn)腸毒素特性研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

6 張璐;金黃色葡萄球菌毒力基因的分布和致病性的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

7 姜蘇娟;基于生物免疫傳感器建立金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法的初步研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

8 賈靜靜;金黃色葡萄球菌噬菌體的分離及其裂解性能的研究[D];江南大學(xué);2012年

9 韋莉;金黃色葡萄球菌反向線性雜交探針檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

10 徐繼達(dá);食源性金黃色葡萄球菌及其腸毒素基因分布研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2612732