發(fā)布時間：2020-04-03 01:27

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種常見的重要病原菌,能夠引起人的表皮感染、敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎及膿毒性關(guān)節(jié)炎等,給人類健康造成嚴重威脅。S.aureus也能引起動物感染,如雞的皮膚膿皰,牛、羊的急慢性乳房炎,豬的流產(chǎn)、皮炎等,給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。由于S.aureus耐藥菌株大量增加,對S.aureus感染采用抗生素治療的效果越來越不理想。因而,免疫治療和免疫預(yù)防成為人們防治S.aureus感染的重要手段。研究發(fā)現(xiàn),S.aureus表面保守的具有較高GAPDH活性和轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合活性的表面蛋白GapC具有良好的免疫原性,能夠誘導機體產(chǎn)生良好的體液免疫保護作用,可作為疫苗的候選抗原。但到目前為止,S.aureus GapC蛋白誘導體液免疫應(yīng)答的B細胞表位尚不清楚。本實驗根據(jù)已發(fā)表的S.aureus GapC基因序列設(shè)計引物,通過PCR方法擴增出GapC基因,與pET32a(+)質(zhì)粒連接,表達重組蛋白GapC。以純化的rGap C蛋白制成免疫原,肌肉接種6-8周齡的雌性BALB/c小鼠。通過雜交瘤技術(shù)及有限稀釋法篩選出2株穩(wěn)定分泌抗體的單克隆雜交瘤細胞株1F4和2A9,隨后對單克隆抗體(mAbs)的亞類、特異性以及對GAPDH酶活性的影響進行了鑒定,并做了被動免疫保護實驗。發(fā)現(xiàn)2株mAbs均為IgG1型,且能夠與S.aureus的rGap C特異性結(jié)合,2株mAbs均能夠抑rGapC蛋白的活性。用2株mAbs被動免疫小鼠后以S.aureus株攻毒,結(jié)果攻毒前靜脈注射mAbs的小鼠存活時間比對照組延長。利用噬菌體展示技術(shù)對GapC蛋白B細胞表位進行淘選,用夾心ELISA方法篩選親和力高的陽性克隆并進行DNA測序。經(jīng)過序列分析,獲得了2個分別與mAb2A9和mAb1F4親和力高的表位~(236)PVATGSLT~(243)和~(272)GYTEDEIV~(279)。人工合成表位基因進行原核表達,并用mAbs對表達產(chǎn)物進行Western blotting分析,其反應(yīng)性良好。將表位序列的氨基酸進行定點突變,確定了構(gòu)成2個表位的關(guān)鍵氨基酸分別是P~(236)、G~(240)、L~(242)、T~(243)和G~(272)、D~(276)、E~(277)、I~(278)、V~(279);進一步采用間接免疫熒光試驗證明2個表位均暴露在菌體表面;用表位免疫接種小鼠的血清進行調(diào)理吞噬實驗,血清能夠明顯增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬細菌的能力;用表位免疫接種小鼠后攻毒,兩個表位均能對免疫小鼠提供良好的免疫保護。以上結(jié)果為進一步研究表位疫苗提供參考。
【圖文】：

組質(zhì)粒 pMD18-T-gapC 的雙酶切及 PCRe recombinant pMD18-T-gapC plasmid by and PCR analysisAMarker; 1: pMD18T-gapC 經(jīng) BamHI 和2: PCR 擴增 gapC 基因. 重組質(zhì)粒的鑒定D18-T-gapC 重組質(zhì)粒和 pET-32a(+收 pMD18-T-gapC 的目的片段和質(zhì)桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，，挑1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示獲得的因測序結(jié)果與 NCBI 序列同源性為

組質(zhì)粒 pET-32a(+)-gapC 的雙酶切及 PCR 鑒of the recombinant pET-32a(+)-gapC plasmid bydigestion and PCR analysis ladder; 1: pET-32a(+)-gapC 經(jīng) BamHI 和 Hind2: PCR 擴增 gapC 基因. Western blotting 鑒定行 SDS-PAGE，蛋白條帶大小與預(yù)期結(jié)并且通過 His-binding-resin 純化柱純化estern blotting進一步證實了重組GapC
【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.611

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本文編號：2612732