【摘要】：纖維素是一種天然高聚體多糖物質(zhì),天然環(huán)境中的含纖維素的物質(zhì)僅有很少一部分得到分解利用。微生物所產(chǎn)的纖維素酶在通常條件下便可以降解纖維素,因而微生物處理是纖維素利用研究的一大熱點(diǎn)。但是,不同種類微生物特點(diǎn)各異,綜合降解能力往往偏低,且降解機(jī)制與過程的研究尚有很多不清楚的地方,因而目前尚難以提升微生物在降解纖維素中的利用價(jià)值。蛋氨酸、賴氨酸和亮氨酸這三種氨基酸在動(dòng)植物蛋白中普遍含量不高,卻在畜牧業(yè)中具有重要的作用。在畜牧飼料應(yīng)用中,這三種氨基酸的需求量很大,但工業(yè)合成這三種氨基酸不僅成本高,而且還有產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)手性的問題,不適合將其直接添加使用。益生菌是一類可以有效改善動(dòng)物機(jī)體內(nèi)微生物菌群組成,在互利共生的代謝過程中可以產(chǎn)生有利于寄主的物質(zhì)或作用的一大類微生物�？莶菅挎邨U菌是益生菌的一種,其益生作用在國內(nèi)外相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道很多,不僅被我國農(nóng)業(yè)部列入安全飼料微生物添加劑名單之中,也被美國FDA認(rèn)定為可安全用于食品與醫(yī)藥的微生物之一。在畜牧飼料中添加枯草芽孢桿菌,能夠顯著提升飼養(yǎng)畜禽的免疫力,改善菌群平衡與機(jī)體消化能力,提高飼料的吸收率,進(jìn)而提升畜禽品質(zhì)。而且枯草芽孢桿菌也是一種優(yōu)秀的產(chǎn)酶微生物,能夠分泌包括纖維素酶在內(nèi)的各類降解酶。本研究首先從益生菌制品中分離純化得到了一株枯草芽孢桿菌,并使用PCR法進(jìn)行了鑒定。研究分析了分離出的枯草芽孢桿菌對(duì)含纖維素類物質(zhì)的降解作用,包括其降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素能力的檢測,相應(yīng)的酶活力的檢測,總蛋白的變化及Met、Lys和Leu的含量變化檢測。然后利用基因工程方法,獲取了枯草芽孢桿菌內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖苷酶基因(endo-beta-1,4-glucanase,CE)。將此基因與表達(dá)載體pHT43酶切重組,構(gòu)建了pHT43-CE內(nèi)源過表達(dá)載體。之后,使用自然感受態(tài)法制作載體菌感受態(tài),成功構(gòu)建過表達(dá)載體后設(shè)計(jì)了試驗(yàn)驗(yàn)證了目的基因在目的菌中的表達(dá)。最后檢測了枯草芽孢桿菌重組菌降解纖維素能力的提升情況以及纖維素酶活力的提升情況。試驗(yàn)結(jié)果表明,枯草芽孢桿菌在試驗(yàn)中表現(xiàn)出較明顯的降解纖維素的效果,不具有降解半纖維素和木質(zhì)素的效果;發(fā)酵產(chǎn)物的總蛋白質(zhì)含量相對(duì)于未添加富含纖維素試驗(yàn)樣品底物的對(duì)照組相比提升了9.4%;發(fā)酵產(chǎn)物中的Met、Lys和Leu含量分別提升了31.4%、42.2%和4.9%。分析表明,枯草芽孢桿菌利用纖維素底物合成更多的蛋白質(zhì)和限制性必需氨基酸。對(duì)轉(zhuǎn)入pHT43-CE的枯草芽胞桿菌進(jìn)行了驗(yàn)證,試驗(yàn)結(jié)果表明成功將pHT43-CE轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中,成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)纖維素酶基因枯草芽孢桿菌工程菌。重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,與未轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌及未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌相比,目的基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平有顯著提升。對(duì)轉(zhuǎn)入pHT43-CE的重組菌降解纖維素能力進(jìn)行了檢測,與未轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌及未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌相比,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌的降解能力有顯著提升。本研究結(jié)果為該重組菌作為飼料添加劑的進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
【圖文】：

材料與方法與方法材料載體菌種載體：大腸桿菌感受態(tài)（Top10 型）購于北京天根生化試劑有限公司菌菌株分離自益生菌藥品制劑（媽咪愛 ，國藥準(zhǔn)字 S20020037，，北。草芽孢桿菌表達(dá)載體為本試驗(yàn)室保存（圖 2-1）。

結(jié)果與分析3 結(jié)果與分析3.1 枯草芽孢桿菌菌種的分離純化與鑒定3.1.1 益生菌菌種的分離、純化與初步鑒定在試驗(yàn)所分離出的多株菌種中，其中僅有一株為桿菌，并且與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中對(duì)芽孢桿菌的描述相近。劃線純化分離三次后得到純化的單菌落。該株菌菌落形態(tài)與鏡下形態(tài)如圖 3-1 中所示。鏡下觀察顯示該株菌為革蘭氏陽性菌，與手冊中枯草芽孢桿菌的描述一致。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)分離純化得到了一株疑似枯草芽孢桿菌的菌株。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;S816.3

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