【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)的主要病原。PCV2在分類上屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus),為閉合單鏈環(huán)狀DNA。PCV2基因組全長為1767bp或1768bp,至少可以編碼11個開放閱讀框(Open reading frame,ORF)。ORF1編碼病毒的復制酶Rep和Rep,蛋白,參與PCV2的復制。ORF2編碼的衣殼蛋白Cap可以自動組裝成病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs),其N端含有一段核定位信號(Nuclear localization signal,NLS),可以引導Cap蛋白進入細胞核,Cap蛋白入核對PCV2的增殖有重要影響作用。前期通過酵母雙雜交實驗,我們篩選到了與Cap蛋白互作的宿主補體1q結(jié)合蛋白(Complement component 1q subcomponent binding protein,C1QBP)。激光共聚焦結(jié)果顯示C1QBP與Cap蛋白在細胞核周圍發(fā)生互作,并改變了Cap蛋白的細胞內(nèi)定位;過表達C1QBP可以顯著抑制PCV2的增殖,據(jù)此我們推測,C1QBP可能是通過抑制Cap蛋白的入核發(fā)揮了抗病毒作用。為證實這一推論,我們用入核抑制劑——伊維菌素抑制Cap蛋白的入核,以揭示抑制入核對PCV2增殖的影響,在此基礎(chǔ)上通過過表達Cap和CapNLS進一步研究了C1QBP抑制PCV2增殖的分子機制。研究獲得以下結(jié)果:(1)用伊維菌素處理PCV2感染的PK-15細胞,可以顯著抑制PCV2的增殖,實時定量檢測結(jié)果顯示伊維菌素處理24 h和48 h,可將PCV2 mRNA表達量降低61%和81%。(2)用伊維菌素處理過表達Cap和CapNLS的細胞,發(fā)現(xiàn)伊維菌素可以阻止Cap和CapNLS進入細胞核;伊維菌素處理改變了Cap和CapNLS的細胞內(nèi)定位,從而證實伊維菌素對Cap的作用位點可能是NLS。(3)在PK-15細胞上過表達C1QBP可以抑制PCV2的增殖,在感染后24 h和48h,過表達C1QBP可以將PCV2 mRNA表達量減少59%和28%。(4)C1QBP可以與Cap和CapNLS發(fā)生互作,抑制Cap和CapNLS進入細胞核,改變了Cap和CapNLS的細胞內(nèi)定位,C1QBP對Cap的作用靶點可能是CapNLS。(5)在PK-15細胞內(nèi)過表達CapNLS可以促進PCV2增殖,但過表達CapNLS對Cap入核發(fā)揮了抑制作用,提示更多復雜的因素參與了Cap的入核。綜上所述,我們證明了伊維菌素和C1QBP可以抑制PCV2的增殖,改變了PCV2結(jié)構(gòu)蛋白Cap的細胞內(nèi)定位,抑制其進入細胞核,但過表達CapNLS不能促進Cap蛋白入核,但能提高PCV2的增殖,提示更多復雜的機制參與了PCV2的增殖。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.651

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本文編號：2610757