【摘要】：2013年春,一種新型H7N9亞型流感病毒首次在我國華東地區(qū)的雞群和人群中爆發(fā)開來,不僅給養(yǎng)禽業(yè)帶來沉重打擊,也對人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。目前,該病毒已在我國人群中連續(xù)引發(fā)了至少5波流行高峰,并且第5波次(2016～2017年)較之前的4個流行波次開始的時間更早,期間感染人數(shù)激增,感染區(qū)域也愈加廣泛;此外,還出現(xiàn)了在HA基因的裂解位點處插入多個堿性氨基酸的高致病性(Highlypathogenic,HP)毒株。HA基因編碼的血凝素是流感病毒表面主要的囊膜蛋白之一,不僅在病毒與宿主細胞唾液酸(Sialic acid,SA)受體結(jié)合、介導(dǎo)病毒囊膜和細胞膜融合過程中起到重要作用;還是流感病毒的主要抗原蛋白,能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體;而且,在病毒致病性方面也發(fā)揮著重要作用。因此,研究H7N9亞型禽流感病毒HA基因隨進化不斷累積的關(guān)鍵氨基酸位點變異及其對病毒受體結(jié)合特異性、抗原性和致病性的影響,對于進一步揭示病毒的進化動態(tài)和指導(dǎo)疫苗設(shè)計以更有效地防控H7N9疫情具有重要意義。1.H7N9亞型禽流感病毒HA基因適應(yīng)性變異的氨基酸位點分析通過檢索全球禽流感共享數(shù)據(jù)庫(the Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data,GISAID),對2013年以來收錄的禽源H7N9亞型流流感病毒HA基因進行多序列比對,重點關(guān)注受體結(jié)構(gòu)域(Receptor binding domain,RBD)附近的適應(yīng)性氨基酸變異;并與人源H7N9毒株的相應(yīng)位點進行對比分析。結(jié)果顯示,共篩選出20個在禽源和人源H7N9病毒的HA上均具有隨年代遞進呈現(xiàn)明顯規(guī)律性變異的氨基酸位點,其中位于RBD區(qū)的突變包括 A121T/P、S127N、A134V、R139K、L177I、M236I(以 H3 計數(shù))這 6 個。在已報道的與H7N9流感病毒受體結(jié)合特性密切相關(guān)的HA關(guān)鍵位點中,絕大多數(shù)禽源和人源毒株均為138C、186V、193K、221P、226L和228G;但2017年度226Q在兩種宿主源病毒中的占比均明顯增加。2.高、低致病性H7N9亞型禽流感病毒拯救及其HA點突變重組病毒的構(gòu)建為了研究上述篩選出的HA適應(yīng)性位點變異及第158位附近糖基化位點的增減對H7N9病毒特性的影響,本研究基于反向遺傳學(xué)技術(shù)分別構(gòu)建了低致病性(Lowpathogenic,LP)病毒株TM24和HP病毒株GD15的8質(zhì)粒系統(tǒng),并成功拯救了 2株母本病毒rTM24(157-160-)和rGD15(157-160+);然后通過基因定點突變方式分別對其HA進行改造,構(gòu)建并拯救了一系列點突變重組病毒,測定了它們的EID50、TCID50。結(jié)果顯示,在LP rTM24(157-160-)的 HA 骨架上分別進行 S127N、R139K、L177I、M236I 的單點突變和這4個位點的NRII、NKII聯(lián)合突變時,除了重組病毒rTM-NRII在雞胚和細胞上的復(fù)制能力較母本毒株有所減弱,其它點突變重組病毒的復(fù)制性能未發(fā)生明顯改變;糖基化位點修飾的重組病毒中,rTM-1(157-160+)在雞胚上的復(fù)制被減弱,而rTM-2(157+160-)和rTM-3(157+160+)的體外復(fù)制能力均得到增強。對于HP rGD15(157-160+)的HA骨架上引入點突變產(chǎn)生的重組病毒中,rGD-1(157-160-)和rGD-2(157+160+)的體外繁殖性能均有所降低,僅rGD-3(157+160-)在雞胚上的復(fù)制強于其母本。3.HA基因點突變重組H7N9病毒的受體結(jié)合特性、抗原性及對小鼠致病性首先利用固相直接結(jié)合ELISA試驗測定了上述點突變重組H7N9病毒的受體特性。結(jié)果顯示,以LP rTM24(157-160-)為HA骨架時,不論是突變RBD區(qū)還是增加糖基化位點,9株點突變重組病毒的受體特性相較于母本均未發(fā)生明顯改變,仍為可同時結(jié)合類禽α2,3-SA受體和類人α2,6-SA受體。而以HP rGD15(157-160+)為HA骨架時,盡管3株點突變重組病毒仍和母本一致為雙受體結(jié)合特異性,但它們對α2,6-SA受體的親和力均有所提高。接下來,通過制備多抗血清進行交叉血凝抑制(Hemagglutinin inhibition,HI)試驗對點突變重組H7N9病毒的抗原性進行了分析。結(jié)果顯示,與LP和HP病毒株交叉反應(yīng)性均較好的抗血清為 rGD-1(157-160-)、rTM-1(157-160+)和 rTM-S127N,HI 滴度分別為10±0.8 log2,9.2±0.8 log2 和 8.9±0.7 log2。而反應(yīng)性相對較差的為 rTM-NKII、rTM-L177I和 rTM-NRII,HI 滴度分別為 6.1 土 1.3 log2、6.3±1.4log2 和 6.4±0.9log2。此外,抗原 R值的計算分析顯示,以LP H7N9的HA為骨架的點突變重組病毒中,rTM-1(157-160+)和rTM-NRII均與母本毒株間存在小的抗原性差異(R=0.5);以HP H7N9的HA為骨架的點突變重組病毒中,rGD-1(157-160-)和rGD-3(157+160-)也均相對母本毒株產(chǎn)生了抗原性差異,且rGD-3(157+160-)與母本毒株間的抗原性有顯著差異(R=0.35)。最后,測定了 HA第158位附近糖基化位點增減對重組H7N9病毒小鼠致病力的影響。結(jié)果顯示,在LPH7N9點突變重組病毒中,rTM-1(157-160+)能夠引起小鼠體重更明顯的下降,其在肺臟的復(fù)制能力也較強,對肺臟的侵襲性也更嚴(yán)重。而HP H7N9點突變重組病毒中,rGD-1(157-160-)能使感染小鼠呈現(xiàn)嚴(yán)重肺炎癥狀,且攻毒后第3天肺臟內(nèi)的病毒滴度顯著高于母本,并極顯著高于rGD-3(157+160-)。綜上所述,本研究基于LP和HP H7N9亞型禽流感病毒骨架,測定并分析了 HA基因RBD區(qū)關(guān)鍵氨基酸位點變異以及158位附近糖基化位點增減對受體結(jié)合特性、抗原性和小鼠致病性的影響。該結(jié)果可為深入探究H7N9病毒的進化規(guī)律、致病機制以及疫苗設(shè)計提供理論參考。
【圖文】：

Ａｖｉｒｎｓ，ＩＡＶ）。病毒粒子多呈球形，直徑大小在８０？１２０ｎｍ。Ｈ７Ｎ９亞型流感病毒為有囊逡逑膜的單股、分節(jié)段、負鏈ＲＮＡ病毒。病毒基因組的大小約為１４０００ｂｐ，按片段由大到小的逡逑順序依次為ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ、ＮＳ。病毒結(jié)構(gòu)（圖１）由外向內(nèi)分為襄逡逑膜、基質(zhì)蛋白外殼、核殼三層。ＨＡ和ＮＡ位于病毒的外表面，構(gòu)成主要的囊膜蛋白。其逡逑中ＨＡ是流感病毒表面重要的抗原性糖蛋白之一，在病毒吸附及與宿主細胞融合過程起重逡逑要作用，并且是決定病毒宿主范圍和組織嗜性的重要因素［５］。流感病毒外表面的第二大蛋逡逑白－神經(jīng)氨酸酶（ＮＡ），則被認為通過切割ＳＡ受體而在病毒粒子的釋放過程中起關(guān)鍵作用。逡逑而３種聚合酶蛋白ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ以及核衣殼蛋白ＮＰ構(gòu)成負責(zé)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的核蛋白復(fù)合逡逑體ＲＮＰ；基質(zhì)蛋白（Ｍｌ）具有維持病毒形態(tài)的作用；Ｍ２主要是離子通道蛋白：非結(jié)構(gòu)蛋逡逑白ＮＳ１通常被認為有拮抗宿主干擾素的作用。逡逑

自２０１３年首次報道人感染Ｈ７Ｎ９病毒病例以來，我國人群中已經(jīng)出現(xiàn)了至少５個流行逡逑波次（Ｅｐｉｄｅｍｉｃ邋ｗａｖｅ）。其中，第５波流行期（２０１６．１０．１？２０１７．９．３０）的感染病例數(shù)急劇增逡逑長并多達７６６例（圖２），超過了此前的任何一次流行高峰；而且，，病毒流行的區(qū)域范圍也逡逑愈加廣泛，呈現(xiàn)自我國東南部逐漸向西蔓延的趨勢，并出現(xiàn)了ＨＡ裂解位點處有插入突變逡逑的高致病性（Ｈｉｇｈｌｙ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ，邋ＨＰ）邋Ｈ７Ｎ９病毒［２，ｎ，１２］。部分研究團隊的結(jié)果還表明，人逡逑體內(nèi)分離到的ＨＰ邋Ｈ７Ｎ９病毒可以在雪貂間進行呼吸道飛沫傳播，且比低致病性（Ｌｏｗ逡逑ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ，邋ＬＰ）邋Ｈ７Ｎ９病毒更具侵襲性，這也進一步加重了公眾對Ｈ７Ｎ９病毒能否在人群逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

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本文編號：2610022