【摘要】：近年來,由于傳統(tǒng)抗生素濫用,導(dǎo)致臨床上多種耐藥菌株、超級(jí)細(xì)菌層出不窮。因此,尋找抗生素替代品迫在眉睫�？咕氖巧矬w抵抗外來微生物入侵時(shí)產(chǎn)生的一類防御性小肽,是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。與傳統(tǒng)抗生素相比,抗菌肽具有分子量小、水溶性好、熱穩(wěn)定性好、抗菌機(jī)理獨(dú)特、對(duì)臨床耐藥菌株具有廣譜抗菌活性,且不易誘發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。本研究,以本課題組從牛紅細(xì)胞血紅蛋白α亞基中分離到的抗菌肽P3類似物抗菌肽JH-3、沙門氏菌CVCC541為研究對(duì)象,對(duì)抗菌肽JH-3抵御沙門氏菌感染的效果開展以下工作:通過對(duì)抗菌肽JH-3活性檢測(cè)和MIC測(cè)定,確定抗菌肽JH-3對(duì)沙門氏菌CVCC541最小抑菌濃度為100μg/mL�？咕腏H-3殺菌動(dòng)力學(xué)研究,結(jié)果表明抗菌肽JH-3在5 h內(nèi)具有良好的殺菌活性,且殺菌作用呈劑量依賴性增強(qiáng)。細(xì)菌通透性研究表明抗菌肽JH-3能夠改變細(xì)菌的通透性,利用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌形態(tài)發(fā)生皺縮,膜完整性被破壞�？咕腏H-3能夠使細(xì)菌膜通透性增加,導(dǎo)致菌內(nèi)容物外泄。以上結(jié)果表明,抗菌肽JH-3具有良好的體外殺菌活性。沙門氏菌CVCC541感染BALB/c小鼠模型的建立,本試驗(yàn)選取感染對(duì)象為20 g BALB/c雌性小鼠,隨機(jī)分成5組,每組10只,分別腹腔注射1ⅹ10~7CFU/mouse、1ⅹ10~6 CFU/mouse、1ⅹ10~5 CFU/mouse、1ⅹ10~4 CFU/mouse的沙門氏菌CVCC541,第5組為PBS對(duì)照組。結(jié)果表明,沙門氏菌CVCC541感染小鼠臨床癥狀嚴(yán)重程度與感染劑量和時(shí)間呈正相關(guān),1ⅹ10~7 CFU/mouse感染小鼠4d內(nèi)全部死亡,1ⅹ10~6 CFU/mouse感染小鼠1周內(nèi)全部死亡,1ⅹ10~5 CFU/mouse呈現(xiàn)出20%的死亡率和1ⅹ10~4 CFU/mouse未見死亡,小鼠感染沙門氏菌CVCC541后表現(xiàn)出被毛松亂、精神萎靡、食欲下降、喜歡聚集,弓背等癥狀。剖檢結(jié)果顯示病理變化嚴(yán)重程度與感染劑量也呈正相關(guān),病變以小腸為主,腸壁變薄,腸內(nèi)出血嚴(yán)重,尤其是空腸和回腸,感染小鼠脾臟嗜中性粒細(xì)胞顯著增加,巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞顯著降低。根據(jù)以上結(jié)果,篩選出1ⅹ10~6 CFU/mouse作為小鼠模型建立的最佳感染劑量,為后續(xù)抗菌肽JH-3進(jìn)行治療性試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。為探究抗菌肽JH-3抵御沙門氏菌CVCC541感染小鼠的治療效果,本實(shí)驗(yàn)選取感染對(duì)象為20 g BALB/c雌性小鼠,隨機(jī)分成8組,每組10只,分別為PBS陰性對(duì)照組、CVCC541感染組、CVCC541+Ciprofloxacin(40 mg/kg,2 h)治療組、CVCC541+JH-3(40 mg/kg,2 h)治療組、CVCC541+JH-3(10 mg/kg,2 h)治療組、CVCC541+Ciprofloxacin(40 mg/kg,P 3 d)治療組、CVCC541+JH-3(10 mg/kg,P3 d)治療組、CVCC541+JH-3(40 mg/kg,P 3 d)治療組。分別以40 mg/kg和10 mg/kg的抗菌肽JH-3劑量在感染小鼠后2 h和3 d進(jìn)行腹腔注射治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染BALB/c小鼠后2 h治療效果優(yōu)于沙門氏菌CVCC541感染后3 d進(jìn)行JH-3治療的效果,可顯著保護(hù)小鼠免受致死劑量沙門氏菌CVCC541的攻擊,小鼠存活率高達(dá)100%,臨床癥狀評(píng)分,血液和臟器荷菌數(shù)降低,小腸腸道病理變化減輕,脾臟中性粒細(xì)胞比例降低,巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞比例增加,均趨于正常值。而感染3 d后的治療效果均較差。本實(shí)驗(yàn)首次將抗菌肽JH-3用于沙門氏菌CVCC541的治療性效果研究,且對(duì)不同劑量和不同治療時(shí)間效果進(jìn)行評(píng)價(jià),為后期新型抗菌藥物的研究奠定基礎(chǔ)。為探索抗菌肽JH-3抵御沙門氏菌CVCC541對(duì)RAW264.7侵襲的作用機(jī)制,將沙門氏菌CVCC541以MOI為10感染RAW264.7,建立沙門氏菌感染RAW264.7細(xì)胞模型,在細(xì)胞模型上評(píng)價(jià)抗菌肽JH-3(終濃度100μg/mL)對(duì)細(xì)胞的效果,采用透射電子顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)抗菌肽JH-3作用后細(xì)胞質(zhì)均勻,細(xì)胞形態(tài)完整。為進(jìn)一步探索抗菌肽JH-3的抗感染機(jī)理,深入研究JH-3抗炎和抗細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,將抗菌肽先1h作用細(xì)胞,后沙門氏菌CVCC541以MOI為10感染RAW264.7,作用12 h后收集細(xì)胞上清和細(xì)胞總蛋白,ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清炎性細(xì)胞因子,并提取細(xì)胞RNA和總蛋白進(jìn)行熒光定量RT-PCR和WB分析。結(jié)果表明,抗菌肽JH-3可以通過抑制p38MAPK信號(hào)通路降低沙門氏菌感染介導(dǎo)的炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α的釋放,表明抗菌肽JH-3具有良好的抗炎效果,激光共聚焦和流式細(xì)胞儀檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)抗菌肽JH-3還可以有效抑制caspase-3和caspase-8的活化,從而降低沙門氏菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

并且能夠與細(xì)胞膜平行，在各種作用力下，抗菌肽最終以“去垢劑”的形式通過使細(xì)菌細(xì)胞膜破壞后，使細(xì)菌發(fā)生死亡。圖1-1 抗菌肽的殺菌方式[10]Fig. 1-1 Sterilization of antimicrobial peptidesSu Jin Ko等在膜模擬環(huán)境下利用圓二色性測(cè)定抗菌肽Macropin的結(jié)構(gòu)為α螺旋結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)抗菌肽Macropin通過破壞細(xì)胞膜與肽聚糖、LPS相結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[11]。Valeriy Domenyuk等將抗菌肽進(jìn)行膜標(biāo)記之后，，研究抗菌肽synbody對(duì)金黃色葡萄球菌（UAB637）的作用方式，使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行結(jié)果觀察，

通過 MIC 測(cè)定發(fā)現(xiàn) JH-3 對(duì)沙門氏菌 CVCC541 的最小抑菌濃度為 100 μg/mL（圖2-1 B）。圖 2-1 抗菌肽 JH-3 抑菌活性和 MIC 測(cè)定Fig. 2-1 Antimicrobial activity of antimicrobial peptides JH-3 and MIC determinationA：抗菌肽 JH-3 對(duì)沙門氏菌 CVCC541 的抑菌結(jié)果；B:抗菌肽 JH-3 對(duì)沙門氏菌 CVCC541最小抑菌濃度檢測(cè)結(jié)果A:Results of antibacterial peptide JH-3 against Salmonella CVCC541; B:Minimal inhibitoryconcentration of antimicrobial peptide JH-3 against Salmonella CVCC5412.2 殺菌動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果為檢測(cè)抗菌肽 JH-3 對(duì)沙門氏菌 CVCC541 的殺菌活性，測(cè)定了細(xì)菌培養(yǎng)物的 OD600值，發(fā)現(xiàn)抗菌肽 JH-3 作用 5 h 后細(xì)菌培養(yǎng)液 OD600降低至 0.4，極顯著低于對(duì)照組（圖 2-2 A，p＜0.001）。對(duì)抗菌肽 JH-3 作用后沙門氏菌 CVCC541活菌數(shù)量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)抗菌肽 JH-3 對(duì)沙門氏菌 CVCC541 的殺菌效率呈現(xiàn)出MIC 依賴性增加，且 1MIC 的抗菌肽 JH-3 與對(duì)沙門氏菌 CVCC541 作用 4 h 可使細(xì)菌數(shù)量降低 1000 倍（圖 2-2 B，p＜0.001）
【學(xué)位授予單位】：河南科技學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S859.7

【相似文獻(xiàn)】

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1 趙雪芹;抗菌肽類似物JH-3抵御沙門氏菌感染的作用機(jī)制研究[D];河南科技學(xué)院;2018年

本文編號(hào)：2609376