【摘要】：近年來,由于傳統(tǒng)抗生素濫用,導致臨床上多種耐藥菌株、超級細菌層出不窮。因此,尋找抗生素替代品迫在眉睫�？咕氖巧矬w抵抗外來微生物入侵時產(chǎn)生的一類防御性小肽,是機體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。與傳統(tǒng)抗生素相比,抗菌肽具有分子量小、水溶性好、熱穩(wěn)定性好、抗菌機理獨特、對臨床耐藥菌株具有廣譜抗菌活性,且不易誘發(fā)細菌產(chǎn)生耐藥性等特點。本研究,以本課題組從牛紅細胞血紅蛋白α亞基中分離到的抗菌肽P3類似物抗菌肽JH-3、沙門氏菌CVCC541為研究對象,對抗菌肽JH-3抵御沙門氏菌感染的效果開展以下工作:通過對抗菌肽JH-3活性檢測和MIC測定,確定抗菌肽JH-3對沙門氏菌CVCC541最小抑菌濃度為100μg/mL�？咕腏H-3殺菌動力學研究,結(jié)果表明抗菌肽JH-3在5 h內(nèi)具有良好的殺菌活性,且殺菌作用呈劑量依賴性增強。細菌通透性研究表明抗菌肽JH-3能夠改變細菌的通透性,利用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡進行細菌形態(tài)學觀察,發(fā)現(xiàn)細菌形態(tài)發(fā)生皺縮,膜完整性被破壞�？咕腏H-3能夠使細菌膜通透性增加,導致菌內(nèi)容物外泄。以上結(jié)果表明,抗菌肽JH-3具有良好的體外殺菌活性。沙門氏菌CVCC541感染BALB/c小鼠模型的建立,本試驗選取感染對象為20 g BALB/c雌性小鼠,隨機分成5組,每組10只,分別腹腔注射1ⅹ10~7CFU/mouse、1ⅹ10~6 CFU/mouse、1ⅹ10~5 CFU/mouse、1ⅹ10~4 CFU/mouse的沙門氏菌CVCC541,第5組為PBS對照組。結(jié)果表明,沙門氏菌CVCC541感染小鼠臨床癥狀嚴重程度與感染劑量和時間呈正相關,1ⅹ10~7 CFU/mouse感染小鼠4d內(nèi)全部死亡,1ⅹ10~6 CFU/mouse感染小鼠1周內(nèi)全部死亡,1ⅹ10~5 CFU/mouse呈現(xiàn)出20%的死亡率和1ⅹ10~4 CFU/mouse未見死亡,小鼠感染沙門氏菌CVCC541后表現(xiàn)出被毛松亂、精神萎靡、食欲下降、喜歡聚集,弓背等癥狀。剖檢結(jié)果顯示病理變化嚴重程度與感染劑量也呈正相關,病變以小腸為主,腸壁變薄,腸內(nèi)出血嚴重,尤其是空腸和回腸,感染小鼠脾臟嗜中性粒細胞顯著增加,巨噬細胞和T淋巴細胞顯著降低。根據(jù)以上結(jié)果,篩選出1ⅹ10~6 CFU/mouse作為小鼠模型建立的最佳感染劑量,為后續(xù)抗菌肽JH-3進行治療性試驗奠定基礎。為探究抗菌肽JH-3抵御沙門氏菌CVCC541感染小鼠的治療效果,本實驗選取感染對象為20 g BALB/c雌性小鼠,隨機分成8組,每組10只,分別為PBS陰性對照組、CVCC541感染組、CVCC541+Ciprofloxacin(40 mg/kg,2 h)治療組、CVCC541+JH-3(40 mg/kg,2 h)治療組、CVCC541+JH-3(10 mg/kg,2 h)治療組、CVCC541+Ciprofloxacin(40 mg/kg,P 3 d)治療組、CVCC541+JH-3(10 mg/kg,P3 d)治療組、CVCC541+JH-3(40 mg/kg,P 3 d)治療組。分別以40 mg/kg和10 mg/kg的抗菌肽JH-3劑量在感染小鼠后2 h和3 d進行腹腔注射治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染BALB/c小鼠后2 h治療效果優(yōu)于沙門氏菌CVCC541感染后3 d進行JH-3治療的效果,可顯著保護小鼠免受致死劑量沙門氏菌CVCC541的攻擊,小鼠存活率高達100%,臨床癥狀評分,血液和臟器荷菌數(shù)降低,小腸腸道病理變化減輕,脾臟中性粒細胞比例降低,巨噬細胞和T淋巴細胞比例增加,均趨于正常值。而感染3 d后的治療效果均較差。本實驗首次將抗菌肽JH-3用于沙門氏菌CVCC541的治療性效果研究,且對不同劑量和不同治療時間效果進行評價,為后期新型抗菌藥物的研究奠定基礎。為探索抗菌肽JH-3抵御沙門氏菌CVCC541對RAW264.7侵襲的作用機制,將沙門氏菌CVCC541以MOI為10感染RAW264.7,建立沙門氏菌感染RAW264.7細胞模型,在細胞模型上評價抗菌肽JH-3(終濃度100μg/mL)對細胞的效果,采用透射電子顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)抗菌肽JH-3作用后細胞質(zhì)均勻,細胞形態(tài)完整。為進一步探索抗菌肽JH-3的抗感染機理,深入研究JH-3抗炎和抗細胞凋亡的分子機制,將抗菌肽先1h作用細胞,后沙門氏菌CVCC541以MOI為10感染RAW264.7,作用12 h后收集細胞上清和細胞總蛋白,ELISA檢測細胞上清炎性細胞因子,并提取細胞RNA和總蛋白進行熒光定量RT-PCR和WB分析。結(jié)果表明,抗菌肽JH-3可以通過抑制p38MAPK信號通路降低沙門氏菌感染介導的炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α的釋放,表明抗菌肽JH-3具有良好的抗炎效果,激光共聚焦和流式細胞儀檢測進一步證實抗菌肽JH-3還可以有效抑制caspase-3和caspase-8的活化,從而降低沙門氏菌誘導的巨噬細胞凋亡。
【圖文】：

并且能夠與細胞膜平行，在各種作用力下，抗菌肽最終以“去垢劑”的形式通過使細菌細胞膜破壞后，使細菌發(fā)生死亡。圖1-1 抗菌肽的殺菌方式[10]Fig. 1-1 Sterilization of antimicrobial peptidesSu Jin Ko等在膜模擬環(huán)境下利用圓二色性測定抗菌肽Macropin的結(jié)構(gòu)為α螺旋結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)抗菌肽Macropin通過破壞細胞膜與肽聚糖、LPS相結(jié)合，導致細菌死亡[11]。Valeriy Domenyuk等將抗菌肽進行膜標記之后，，研究抗菌肽synbody對金黃色葡萄球菌（UAB637）的作用方式，使用激光共聚焦顯微鏡進行結(jié)果觀察，

通過 MIC 測定發(fā)現(xiàn) JH-3 對沙門氏菌 CVCC541 的最小抑菌濃度為 100 μg/mL（圖2-1 B）。圖 2-1 抗菌肽 JH-3 抑菌活性和 MIC 測定Fig. 2-1 Antimicrobial activity of antimicrobial peptides JH-3 and MIC determinationA：抗菌肽 JH-3 對沙門氏菌 CVCC541 的抑菌結(jié)果；B:抗菌肽 JH-3 對沙門氏菌 CVCC541最小抑菌濃度檢測結(jié)果A:Results of antibacterial peptide JH-3 against Salmonella CVCC541; B:Minimal inhibitoryconcentration of antimicrobial peptide JH-3 against Salmonella CVCC5412.2 殺菌動力學檢測結(jié)果為檢測抗菌肽 JH-3 對沙門氏菌 CVCC541 的殺菌活性，測定了細菌培養(yǎng)物的 OD600值，發(fā)現(xiàn)抗菌肽 JH-3 作用 5 h 后細菌培養(yǎng)液 OD600降低至 0.4，極顯著低于對照組（圖 2-2 A，p＜0.001）。對抗菌肽 JH-3 作用后沙門氏菌 CVCC541活菌數(shù)量進行測定，發(fā)現(xiàn)抗菌肽 JH-3 對沙門氏菌 CVCC541 的殺菌效率呈現(xiàn)出MIC 依賴性增加，且 1MIC 的抗菌肽 JH-3 與對沙門氏菌 CVCC541 作用 4 h 可使細菌數(shù)量降低 1000 倍（圖 2-2 B，p＜0.001）
【學位授予單位】：河南科技學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S859.7

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1 趙雪芹;抗菌肽類似物JH-3抵御沙門氏菌感染的作用機制研究[D];河南科技學院;2018年

本文編號：2609376