【摘要】：體細(xì)胞核移植(SCNT)是一種哺乳動物生物醫(yī)學(xué)研究方面的有價值的工具。但是SCNT效率一直很低,困擾著克隆豬的應(yīng)用。目前認(rèn)為克隆效率低的主要原因是異常的表觀遺傳修飾導(dǎo)致的。利用組蛋白去乙�；种苿�(HDACi),可以修正異常的表觀遺傳重編程,進(jìn)而提高豬SCNT胚胎的體外發(fā)育能力。MGCD0103、PCI-24781、M344、Quisinostat 和 CI994 是 HDACi,他們都具有促進(jìn)組蛋白乙�；降哪芰�,但是尚未在豬SCNT研究中報道。本研究是第一次使用這五種HDACi探究其對豬核移植胚胎發(fā)育的影響。方法:利用不同濃度的 HDACi(MGCD0103、PCI-24781、M344、Quisinostat和CI994)處理豬克隆胚胎24小時,找出最佳處理濃度,隨后用最佳處理濃度處理不同時間,找出最佳的HDACi處理時間。確定好五種HDACi的最佳處理條件后,通過免疫熒光染色方法和PCR等方法確定豬SCNT胚胎中組蛋白乙�；�、DNA甲基化水平、凋亡水平以及多能性和凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平。每種HDACi處理后的克隆胚胎將被移入待遇母豬體內(nèi),觀察胎兒發(fā)育情況。結(jié)果:(1)與對照組相比,0.2 μ的MGCD0103處理豬克隆胚胎24 h可以顯著提高豬SCNT胚胎的囊胚形成率(25.5%vs.10.7%;P0.05)。之后用MGCD0103處理6小時的豬SCNT胚胎使用H3K9和H4K12抗體進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果顯示,MGCD0103處理的假原核期豬核移植胚胎中組蛋白H3K9的乙�；�(AcH3K9)和組蛋白H4K12的乙�；�(AcH4K12)均顯著地高于對對照組。體內(nèi)移植實驗結(jié)果表明CI994處理的豬SCNT胚胎移入2頭代孕母豬后,獲得3個克隆胎兒。這些結(jié)果說明MGCD0103可以增強核重編程并提高豬SCNT胚胎的體外發(fā)育能力。(2)與對照組相比,0.5nM的PCI-24781處理豬克隆胚胎6小時可以顯著提高豬SCNT胚胎的體外囊胚形成率(25.3%vs.10.5%;P0.05)。之后用PCI-24781處理6小時的豬SCNT胚胎使用H3K9和H4K12抗體進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果顯示,PCI-24781處理的假原核期豬核移植胚胎中AcH3K9和AcH4K12均顯著地高于對對照組。而且TUNEL結(jié)果表明PCI-24781處理可以顯著抑制SCNT胚胎的凋亡的細(xì)胞數(shù)。體內(nèi)移植實驗結(jié)果表明PCI-24781處理的豬SCNT胚胎移入3頭代孕母豬后,獲得2個豬胎兒。綜上所訴,PCI-24781處理可以明顯提高體細(xì)胞核重編程的能力和豬SCNT胚胎的發(fā)育能力。(3)與未處理對照組相比,5 μM的M344處理豬克隆胚胎6小時可以顯著提高豬SCNT胚胎的體外囊胚形成率(25.1%vs.10.9%;P0.05)。而且M344處理可以顯著提高假原核期豬克隆胚胎中AcH4K12平均熒光強度。但是多能性相關(guān)基因Oct4,NANOG和SOX2的mRNA表達(dá)水平在M344處理組和未處理組之間沒有顯著性差異。體內(nèi)移植實驗結(jié)果表明CI994處理的豬SCNT胚胎移入3頭代孕母豬后,獲得3個克隆胎兒。綜上所訴,M344處理可以提升組蛋白乙�；�、促進(jìn)核重編程的能力并且提高豬SCNT胚胎的體外發(fā)育能力。(4)與未處理對照組相比,10 nM的Quisinostat處理豬克隆胚胎24小時可以顯著提高豬SCNT胚胎的體外囊胚形成率(19.0%vs.10.2%;P0.05)。而且Quisinostat處理可以顯著提高假原核期豬克隆胚胎中AcH3K9平均熒光強度。同樣,免疫熒光結(jié)果證實Quisinostat處理可以明顯促進(jìn)豬核移植囊胚中POU5F1的表達(dá)水平。PCR結(jié)果證明Quisinostat處理明顯提升了 BCL2的mRNA表達(dá)水平,但是BAX的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異。體內(nèi)移植實驗結(jié)果表明Quisinostat處理的豬SCNT胚胎移入3頭代孕母豬后,獲得6個豬克隆胎兒。綜上所訴,Quisinostat處理可以調(diào)整表觀遺傳修飾、促進(jìn)核重編程,進(jìn)而提高豬SCNT胚胎的發(fā)育能力和囊胚質(zhì)量。(5)與對照組相比,10μ 的CI994處理豬克隆胚胎24小時可以顯著提高豬SCNT胚胎的囊胚形成率(21.9%vs.11.4%;P0.05)。雖然CI994處理可以顯著提高假原核期豬核移植胚胎中AcH3K9和AcH4K12的平均熒光強度,但是在囊胚期中AcH3K9和AcH4K12的平均熒光強度沒有顯著性差異。免疫熒光結(jié)果證明CI994可以顯著促進(jìn)SCNT囊胚中POU5F1的表達(dá),但不影響5mC的平均熒光強度。TUNEL結(jié)果表明CI994處理可以顯著抑制SCNT胚胎的凋亡的細(xì)胞數(shù)。PCR結(jié)果表明多能性相關(guān)基因POU5F1和SOX2的mRNA表達(dá)水平在CI994處理組中顯著高于未處理組。體內(nèi)移植實驗結(jié)果表明CI994處理(10 μM for 24 h)的豬SCNT胚胎移入3頭代孕母豬后,獲得3個豬胎兒。綜上所訴,CI994處理可以提升組蛋白乙�；�、增強體細(xì)胞核重編程的能力,進(jìn)而提高豬SCNT胚胎的體外發(fā)育能力。結(jié)論:組蛋白去乙�；种苿㎝GCD0103(0.2μM,24小時)、PCI-24781(0.5 nM,6 小時)、M344(5 μM,6 小時)Quisinostat(10 nM,24 小時)及 CI994(10μM,24小時)處理豬核移植克隆胚胎可以顯著增強組蛋白乙�；健⒁种萍�(xì)胞的凋亡、促進(jìn)多能性相關(guān)基因的表達(dá)、提高體細(xì)胞核重編程能力和體外發(fā)育能力。
【圖文】：

ＭＧＣＤ０１０３處理后的第７天的豬ＳＣＮＴ囊胚。。（Ｂ）第７天的豬ＳＣＮＴＩＩ胚經(jīng)Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２１００邋ｊｉｍ。（Ｃ）第７天的豬ＳＣＮＴＪＩ胚經(jīng)Ｐ丨染０邋ｐｍ。（Ｄ）第７天的豬ＳＣＮＴ囊胚合并后的圖０邋ｉｎｍ。逡逑ｙ邋７邋ｐｏｒｃｉｎｅ邋ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ＭＧＣＤｆｉｃａｔｉｏｎ，邋１００．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋１００邋ｆｉｍ．邋（Ｂ）邋Ａ邋Ｄａｙ邋７ｅｃｈｓｔ邋３３３４２．邋Ｏｒｉｇｉｎａｌ邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ，邋２００．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂｆｔｅｒ邋ＳＣＮＴ邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＰＩ．邋Ｏｒｉｇｉｎａｌ邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ａ邋ｐｏｒｃｉｎｅ邋ＳＣＮＴ邋ｅｍｂｒｙｏ邋００．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋１００邋＾ｍ．逡逑胚胎經(jīng)過電激活后，用０．２邋ｐＭ的ＭＧＣＤ同的時間（Ｏｈ、６邋ｈ、２４邋ｈ、４８邋ｈ，其中ＯＭＧＣＤ０１０３的體外培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，，

同樣為了解釋提高豬克隆胚胎的體外發(fā)育能力的機制，當(dāng)豬核移植逡逑胚胎發(fā)育到假原核期時，另一個表觀遺傳標(biāo)志位點ＡｃＨ４Ｋｌ２的強度也被逡逑通過免疫熒光方法檢測了。圖３．３證明表觀遺傳標(biāo)志位點ＡＣＨ４Ｋ１２的平逡逑均強度在０．２邋的ＭＧＣＤ０１０３處理組明顯地高于０邋ｇＭ的ＭＧＣＤ０１０３逡逑處理組。逡逑２５逡逑
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S828;Q813

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 紀(jì)慧麗;盧晟盛;潘登科;;體細(xì)胞核移植后表觀遺傳重編程的異常及其修復(fù)[J];遺傳;2014年12期

2 Shuchen Zhang;Wei Cui;;Sox2, a key factor in the regulation of pluripotency and neural differentiation[J];World Journal of Stem Cells;2014年03期

本文編號：2609062