【摘要】：作為一種高度特化的雌性生殖細胞,哺乳類動物卵母細胞是動物個體發(fā)生的主體細胞。大量研究表明,卵母細胞的成熟質(zhì)量與其受精后胚胎發(fā)育能力直接相關(guān),同時體外成熟的卵母細胞是體外受精、體外胚胎生產(chǎn)、胚胎移植等一系列胚胎生產(chǎn)技術(shù)研究的基礎(chǔ)。然而,與體內(nèi)成熟相比,目前大家畜卵母細胞體外成熟效率、囊胚發(fā)育率、母體受孕率均較低。這與卵母細胞核質(zhì)成熟不同步、細胞質(zhì)成熟不充分、體外成熟體系不完善有關(guān),同時有關(guān)大家畜卵母細胞成熟分子機制尚不完全清楚也是關(guān)鍵因素之一。卵子在生長和成熟過程中逐步獲得成熟、受精和胚胎發(fā)育的能力,這些能力的獲得與蛋白質(zhì)合成、修飾、降解和聚積密切相關(guān)。因此,應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究卵母細胞成熟過程中蛋白質(zhì)合成代謝變化規(guī)律將有望進一步揭示卵母細胞成熟的分子機制,對提高卵母細胞體外成熟質(zhì)量具有重要意義。本研究以具有地方特色的廣西本地水牛為對象,應用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)對體外成熟前后、胞質(zhì)正常與異常的水牛卵母細胞進行蛋白質(zhì)組學研究。構(gòu)建成熟前、后水牛卵母細胞蛋白質(zhì)組表達譜,鑒定體外成熟前后卵母細胞表達差異蛋白。通過生物學信息學分析,研究差異蛋白在水牛卵子成熟過程中的功能及參與的生物學途徑,以確定與水牛卵母細胞成熟相關(guān)的重要蛋白,并揭示水牛卵母細胞體外成熟的分子機制。首先,應用一維凝膠電泳結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)構(gòu)建成熟前、后水牛卵母細胞蛋白質(zhì)組表達譜。分別從體外成熟前、后的水牛卵母細胞中鑒定到647和570(FDR1%)種蛋白質(zhì),其中相同鑒定蛋白414種,占總鑒定蛋白的51.6%。成熟前后的水牛卵子中均有9種高豐度表達蛋白質(zhì),其中8種為相同鑒定蛋白,包括穹窿體蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3、醛糖還原酶、過氧化物還原酶2、二磷酸核苷酸激酶B、動力蛋白輕鏈1、蛋白精氨酸脫亞氨酶6、類甘油醛-3-三磷酸脫氫酶同源物2。對成熟前、后卵母細胞相同、特有鑒定蛋白的生物信息學分析發(fā)現(xiàn),相同鑒定蛋白在包括丙酮酸鹽代謝、糖酵解/糖原生成、TCA循環(huán)、結(jié)氨酸,亮氨酸和異亮氨酸的降解、丙酸代謝、脂肪酸代謝和磷酸戊糖途徑等23條KEGG信號通路顯著相關(guān)(p0.05)。表明能量代謝途徑在水牛卵母細胞成熟過程中發(fā)揮重要作用,它們?yōu)槁涯讣毎某墒焯峁┠芰縼碓�、保證卵母細胞減數(shù)分裂的完成。成熟前卵子特有鑒定蛋白與氧化磷酸化、核糖體、蛋白酶體等信號通路顯著相關(guān)(p0.05);成熟后卵子特有鑒定蛋白與DNA復制、氨基糖和核苷酸糖代謝信號通路顯著相關(guān)(p0.05)。結(jié)果還同時表明一些蛋白貫穿整個卵子成熟過程,并發(fā)揮重要作用。此外,卵母細胞在不同的發(fā)育時期特異表達一些蛋白,參與維持其必需的生長和發(fā)育。其次,應用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)對成熟前、后和胞質(zhì)正常與異常的水牛卵母細胞進行了研究。從成熟前后及胞質(zhì)正常與異常的水牛卵母細胞共鑒定到3857(FDR1%)種蛋白質(zhì),可定量蛋白數(shù)3245種。進一步分析顯示,兩肽段以上鑒定蛋白數(shù)達到3287種,占總鑒定蛋白的85%。與已報道的牛卵母細胞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集(占總鑒定量的34%-88%)相近。胞質(zhì)正常MⅡ期卵子和GV期卵子比較篩選出173種差異表達蛋白,其中上調(diào)表達108種,下調(diào)表達65種。胞質(zhì)正常與胞質(zhì)異常的MⅡ期水牛卵子比較篩選出146種差異表達蛋白,其中111種上調(diào)表達,35種下調(diào)表達。胞質(zhì)正常MⅡ期卵子和GV期卵子的差異表達蛋白GO分析顯示,上調(diào)蛋白主要參與基于微管過程、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、能量產(chǎn)生和物質(zhì)代謝及細胞周期等生物學進程。胞質(zhì)正常MⅡl期卵子與胞質(zhì)異常MII期卵子比較的差異表達蛋白GO分析顯示,上調(diào)蛋白主要參與氧化還原、翻譯、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、氧化磷酸化及小G蛋白信號轉(zhuǎn)導途徑等生物學進程。相較于GV期細胞和胞質(zhì)異常MⅡ期卵母細胞,氧化磷酸化信號通路中參與電子轉(zhuǎn)運呼吸鏈的關(guān)鍵酶在胞質(zhì)正常MⅡ期細胞中表達均顯著上調(diào)。表明氧化磷酸化水平顯著影響水牛卵子的成熟質(zhì)量,是卵子減數(shù)分裂和發(fā)育能力的重要過程;表明卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程需要大量的能量供給,提示MII期卵母細胞在為隨后的受精過程所需的能量代謝做充分的準備。在上述研究過程中發(fā)現(xiàn),樣品中小分子量、低豐度蛋白在進行質(zhì)譜鑒定時,產(chǎn)生可測序肽段的數(shù)量少,其信號極易受高豐度蛋白信號的抑制和掩蓋,致使小分子量、低豐度蛋白無法被鑒定出來,而這些小分子量、低豐度蛋白又具有極其重要的生理功能。為此,研究發(fā)展了一種能有效分離、富集小分子量、低豐度蛋白質(zhì)和去除高豐度蛋白的“Gel-filter”的凝膠分離方法。結(jié)果顯示,隨著血清樣品上樣量的增加,小分子量蛋白條帶逐漸加深,表明隨著蛋白量的增加,富集效果明顯。經(jīng)過該方法處理的樣品,蛋白質(zhì)相對豐度不發(fā)生改變。將該方法與文獻報道的其他三種常用分離方法進行了比較,并利用質(zhì)譜技術(shù)進行鑒定分析。結(jié)果顯示,Gel-filter方法共鑒定到559(FDR1%)種血清小分子量蛋白質(zhì),為四種方法中鑒定數(shù)最高。對鑒定的小分子量蛋白、肽段進行分子量分布分析顯示,在各分子量區(qū)間,Gel-filter方法的鑒定數(shù)為四種方法中最高。以譜圖數(shù)表示蛋白的豐度并進行歸一化后對四種方法共同鑒定的小分子量蛋白豐度分布進行分析,Gel-filter方法富集的小分子量蛋白豐度分布范圍相對較寬。通過Gel-filter方法富集到的小分子量蛋白可獲得更高的蛋白序列覆蓋度。為進一步評估不同方法小分子量蛋白的回收效率,通過在血清樣品中加入大腸桿菌誘導表達的輕穩(wěn)定同位素標記的GST蛋白(26kDa)后,分別經(jīng)不同方法處理。質(zhì)譜鑒定分析顯示,Gel-filter方法處理GST蛋白的回收效率為33.1 ±0.01%,顯著高于 Differential solubilization(DS)和 ProteoMiner 試劑盒方法,后兩種方法處理GST蛋白的回收效率分別為18.7 ± 0.01%和9.6 ±0.03%。上述結(jié)果表明,Gel-filter方法作為一種操作簡便、有效以及重現(xiàn)性好的分離富集方法,可為蛋白質(zhì)組學的研究提供有效的工具。
【圖文】：

誘導的減數(shù)分裂恢復［３６，３７］。卵子中ｃＡＭＰ濃度下降導致ＰＫＡ失活，下游分子Ｃｄｃ２５發(fā)逡逑生去磷酸化被活化以及Ｗｅｅｌ／Ｍｙｔｌ去磷酸化失活，從而使ＣＤＫ１去磷酸化激活了邋ＭＰＦ，，逡逑卵母細胞恢復減數(shù)分裂＾３９］（如圖１－２所示）。逡逑４逡逑

使ＡＰＣ／Ｃ從Ｅｍｉ２－ＡＰＣ／Ｃ復合物中解離出去，保持ＣＳＦ起阻滯作用然而，研宄發(fā)逡逑現(xiàn)，ＲＳＫ敲除的小鼠卵子仍處于ＣＳＦ起阻滯作用的狀態(tài)，表明可能存在其他通路參與逡逑Ｅｍｉ２磷酸化以及與ＰＰ２Ａ結(jié)合（如圖１－３所示）。逡逑ＡＫ７Ｃ邐ＩｎｈｉｂｉｔｅｄＡＲＣ／Ｃ邐＊邋Ｊ邋｜邋ＷＴＯ邋ｉ逡逑圖１－３發(fā)育阻滯于Ｍｉｌ期的大鼠卵母細胞逡逑Ｆｉｇ．１－３邋ＭＩＩ－ａｒｅｅｓｔｅｄ邋ｒａｔ邋ｏｏｃｙｔｅ邋（Ｔｒｉｐａｔｈｉ邋ｅｔ邋ａｉ，２０＼０）逡逑１．３蛋白質(zhì)組學研宄概述逡逑蛋白質(zhì)組概念最早由Ｗｉｌｋｉｎｓ等于上種世紀９０年代提出［１（）２］。蛋白質(zhì)組學是以一種逡逑細胞、一種組織或生物體內(nèi)表達的全部蛋白質(zhì)為研究對象，系統(tǒng)研宄蛋白表達、亞細胞逡逑定位、蛋白間相互作用、翻譯后修飾等，比較不同的空間、時間及細胞類型蛋白質(zhì)組的逡逑動態(tài)變化［１（）３］。因此，蛋白質(zhì)組的研究比基因組研宄更具挑戰(zhàn)性和意義性。逡逑從１９９４年蛋白質(zhì)組學概念的提出到今天，隨著肽段／蛋白分離技術(shù)不斷推陳出新、逡逑穩(wěn)定同位素標記定量技術(shù)的廣泛應用、質(zhì)譜分析及生物信息學的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)組學逡逑研宄進入了快速發(fā)展階段。質(zhì)譜也逐步發(fā)展成為大規(guī)模蛋白質(zhì)組分析的核心工具。過去逡逑十年間，質(zhì)譜儀器的飛速發(fā)展，在測量精度、分辨率、準確性、靈敏度及掃描速度等方逡逑面均得到具大提升
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S823.83


本文編號：2606707