【摘要】：奶牛乳腺炎是造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的主要疾病之一,根據(jù)癥狀表現(xiàn)可分為臨床和隱性乳腺炎,無(wú)論哪種類型乳腺炎均以泌乳量大幅度下降為特征,主要是由于承擔(dān)泌乳功能的乳腺上皮細(xì)胞在發(fā)病過(guò)程中遭受損傷所致,損傷的原因,一方面可能源自病原;另一方面,乳腺腺泡導(dǎo)管系統(tǒng)內(nèi)存在數(shù)量巨大的中性粒細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞,這些免疫細(xì)胞可通過(guò)釋放胞外誘捕網(wǎng)、吞噬和降解等方式殺滅進(jìn)入乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)的病原,在此過(guò)程中也可能會(huì)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞造成損傷。胞外誘捕網(wǎng)作為一種近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的天然免疫應(yīng)答機(jī)制,在發(fā)揮抗病原作用的同時(shí),可被迅速降解,若胞外誘捕網(wǎng)形成過(guò)多或降解不及時(shí),則可能引起組織或器官的免疫性損傷。奶牛乳腺炎發(fā)生時(shí),出現(xiàn)在乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)殘存乳汁當(dāng)中的中性粒細(xì)胞是否會(huì)釋放胞外誘捕網(wǎng)殺滅病原?乳腺上皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的泌乳能力下降是否也與胞外誘捕網(wǎng)有關(guān)?這些問(wèn)題的解答對(duì)于闡述奶牛乳腺炎詳細(xì)的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。本論文通過(guò)建立胞外誘捕網(wǎng)定性與定量分析方法,證實(shí)乳腺腺泡內(nèi)是否存在胞外誘捕網(wǎng),進(jìn)而分析對(duì)乳腺組織的損傷情況,并初步揭示胞外誘捕網(wǎng)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的損傷機(jī)制。首先,建立胞外誘捕網(wǎng)的定性與定量分析方法。利用不同類型的刺激物刺激天然免疫細(xì)胞,建立了掃描電鏡和激光共聚焦為基礎(chǔ)的胞外誘捕網(wǎng)形態(tài)學(xué)定性分析方法;利用染料Sytox Green和Pico Green與熒光酶標(biāo)儀建立了不同類型刺激物刺激胞外誘捕網(wǎng)形成的定量分析方法,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展提供了方法學(xué)的支持。其次,證實(shí)乳腺炎小鼠乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)內(nèi)存在中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng),并且胞外誘捕網(wǎng)的釋放與乳腺上皮損傷密切相關(guān)。分別利用脂多糖和金黃色葡萄球菌建立臨床和隱性乳腺炎小鼠模型,制作乳腺組織石蠟切片,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種類型乳腺炎小鼠,乳腺組織均呈現(xiàn)水腫、腺泡結(jié)構(gòu)完整性破壞及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);ELISA檢測(cè)乳腺組織炎性細(xì)胞因子水平變化,結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β和IL-6的水平顯著升高;掃描電鏡和激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn),乳腺炎小鼠模型組的乳腺腺泡導(dǎo)管內(nèi)存在典型的胞外誘捕網(wǎng)結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)主要由DNA骨架和組蛋白、彈性蛋白及髓過(guò)氧化物酶組成;利用能夠降解胞外誘捕網(wǎng)的DNase I腹腔注射預(yù)處理小鼠,臨床和隱性乳腺炎小鼠乳腺組織損傷程度減輕,細(xì)胞因子水平降低;利用胞外誘捕網(wǎng)抑制劑Cl-amidine腹腔注射預(yù)處理小鼠,也可以改善金葡菌和脂多糖引起的乳腺組織損傷。以上結(jié)果證實(shí),乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)內(nèi)胞外誘捕網(wǎng)的水平與乳腺組織損傷情況密切相關(guān)。再次,體外研究胞外誘捕網(wǎng)對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞的損傷機(jī)制。利用PMA刺激小鼠中性粒細(xì)胞后收集上清,提取胞外誘捕網(wǎng),將胞外誘捕網(wǎng)和降解成分分別加入小鼠乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液孵育,結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶水平均顯著升高,提示胞外誘捕網(wǎng)及其降解成分都對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞呈現(xiàn)毒性作用;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)組蛋白單獨(dú)刺激小鼠乳腺上皮細(xì)胞,培養(yǎng)上清中的乳酸脫氫酶水平也顯著升高,提示胞外誘捕網(wǎng)的主要成分組蛋白可損傷小鼠乳腺上皮細(xì)胞;小鼠乳導(dǎo)管注入組蛋白觀察乳腺組織病理學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)組蛋白可引起小鼠乳腺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腺泡結(jié)構(gòu)完整性破壞、細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的水平顯著升高,以上實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞和組織水平上均證實(shí)組蛋白對(duì)乳腺上皮細(xì)胞具有損傷作用;為進(jìn)一步分析組蛋白損傷小鼠乳腺上皮的作用機(jī)制,在培養(yǎng)上清中加入不同濃度的組蛋白處理小鼠乳腺上皮細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)和蛋白免疫印跡分析證實(shí)組蛋白可誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死和焦亡。最后,在本體動(dòng)物奶牛上進(jìn)一步證實(shí)胞外誘捕網(wǎng)損傷奶牛乳腺上皮細(xì)胞的作用機(jī)制。植塊法和差速消化法分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞,經(jīng)角蛋白-18和免疫熒光鑒定,證實(shí)獲得了原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞;PMA刺激奶牛中性粒細(xì)胞,收集上清提取胞外誘捕網(wǎng),然后將胞外誘捕網(wǎng)和降解成分分別加入奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液孵育,結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶水平均顯著升高,提示胞外誘捕網(wǎng)及其降解成分都對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞呈現(xiàn)毒性作用;培養(yǎng)上清中加入不同濃度的組蛋白處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞,分析發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)減慢、皺縮變圓,上清中乳酸脫氫酶水平顯著升高,提示組蛋白對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞具有毒性作用;流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,奶牛乳腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡(Annexin V+/PI-)、壞死(Annexin V+/PI+)和焦亡(Annexin V-/PI+)等死亡方式;蛋白免疫印跡進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)組蛋白激活caspase-1、NLRP3和caspase-3,從而誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死和焦亡。通過(guò)以上研究,本論文證實(shí)了乳腺導(dǎo)管系統(tǒng)內(nèi)存在中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng),胞外誘捕網(wǎng)的主要組成成分組蛋白可通過(guò)激活caspase-1、NLRP3和caspase-3,誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生焦亡、凋亡和壞死,從而損傷乳腺組織。以上研究補(bǔ)充了有關(guān)奶牛乳腺炎疾病發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中乳腺上皮損傷導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降的詳細(xì)機(jī)制,為奶牛乳腺炎免疫學(xué)防治研究提供了新的研究視角,同時(shí)也為獸醫(yī)臨床實(shí)踐中有效防控乳腺炎的發(fā)生提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

圖 1.1 掃描電鏡法觀察中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的胞外誘捕網(wǎng)。（A）中性粒細(xì)胞胞外網(wǎng)觀察（B）巨噬細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)結(jié)構(gòu)觀察。Figure 1.1 SEM analysis of NETs and METs formation. (A). Observation of NETs-lietwork structures. (B) Observation of bovine macrophages ETs-like network structures.

1.2 免疫熒光法檢測(cè) NETs 的 DNA 與 Histone、NE 和 MPO 共定位情況(90me(綠色)。（D）MPO(綠色)。（G）NE(綠色)。（B）、（E）和（H）代表 DNA(紅色（I）分別分別代表 Histone、NE 和 MPO 與 DNA 合并圖像。gure 1.2 Immunofluoresce analysis of DNA decorated with Histone, NE andtructures (90min). DNA decorated with of Histone, NE and MPO within NETs wer
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.23

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 夏杰;王蓉;周劍濤;;中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)與急性肺損傷[J];生命的化學(xué);2015年02期

2 夏書月;郭丹;許小楊;劉放;王實(shí);;中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)與血栓形成的關(guān)系[J];中華肺部疾病雜志(電子版);2015年05期

3 夏杰;王蓉;;病原體逃逸中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)機(jī)制[J];微生物學(xué)雜志;2015年06期

4 張妍;馬瑞爽;司宇;吳曉明;鄧瑞娟;史文杰;于牧鑫;史家嵐;;中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)和血栓形成的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2016年03期

5 劉青;葉鵬;Franck G;Mawson TL;Folco EJ;Molinaro R;Ruvkun V;Engelbertsen D;Liu X;Tesmenitsky Y;Shvartz F;Sukhova GK;Michel JB;Nicoletti A;Lichtman AH;Wagner DD;Croce KJ;Libby P;;肽酰基精氨酸脫亞氨酶4和中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成在實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈損傷中的作用:淺表糜爛的影響[J];中華高血壓雜志;2018年05期

6 倪睿;魏豐賢;丁界先;徐小東;張有成;;中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)的研究現(xiàn)狀[J];免疫學(xué)雜志;2016年04期

7 楊春艷;李亞軍;;中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)在炎癥相關(guān)疾病中的研究進(jìn)展[J];微生物與感染;2017年04期

8 吳德海;張樹庚;劉連新;;中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)在腫瘤形成過(guò)程中的作用機(jī)制研究[J];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào);2018年10期

9 周劍濤;梅雨珍;丁海峰;;中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)蛋白質(zhì)的免疫原性[J];分子診斷與治療雜志;2014年01期

10 吳騰飛;陳福廣;黃清華;陳偉;鄧旭明;張巧靈;劉波;;中性粒細(xì)胞殺滅病原體的新途徑:胞外誘捕網(wǎng)[J];免疫學(xué)雜志;2013年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 梁俏美;馬仁舒;李春妹;沈佳程;梁妍雯;劉偉;;影響中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)發(fā)揮作用的因素[A];第十二屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)摘要匯編[C];2017年

2 尹曉雪;劉彥虹;;中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的產(chǎn)生及其作用的研究[A];第九屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2014年

3 廖成水;程相朝;;胞外誘捕網(wǎng)(Extracellular Traps,ETs):先天性免疫細(xì)胞第三種殺傷機(jī)制[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物微生態(tài)學(xué)分會(huì)第五屆第十二次全國(guó)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2016年

4 馬芳;郭曉;范紅結(jié);;馬鏈球菌獸疫亞種通過(guò)分泌胞外核酸酶降解中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)來(lái)逃避宿主免疫系統(tǒng)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)第五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2016年

5 王妍;;p38調(diào)節(jié)/活化的蛋白激酶(PRAK)對(duì)于中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(NET)形成的影響[A];第十二屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)分會(huì)場(chǎng)交流報(bào)告集[C];2017年

6 廖成水;程相朝;;胞外誘捕網(wǎng)(Extracellular Traps,ETs):先天性免疫細(xì)胞第三種殺傷機(jī)制[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)病理學(xué)分會(huì)第二十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)暨中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)動(dòng)物病理生理專業(yè)委員會(huì)第二十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2015年

7 吳小婷;萬(wàn)建新;;中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)和補(bǔ)體C3在急性腎損傷中的作用[A];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)腎臟疾病專業(yè)委員會(huì)2018年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2018年

8 馬云華;王辰;王環(huán);陳e，

本文編號(hào)：2605009