【摘要】：牛呼吸道合胞體病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)是副黏病毒科、肺病毒亞科、肺病毒屬的成員,為有囊膜病毒,其基因組是負鏈RNA,全長約15000 nt,可轉(zhuǎn)錄出10條病毒RNA,并翻譯成11種蛋白質(zhì),其中9種為結(jié)構(gòu)蛋白、2種為非結(jié)構(gòu)蛋白。BRSV呈世界性分布,在我國的流行也比較普遍。BRSV感染牛如果繼發(fā)性細菌感染,呼吸系統(tǒng)疾病會更加復雜,是發(fā)病牛高度死亡的主要原因,給養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。疫苗免疫仍是防控該病的有力手段�；诜聪蜻z傳技術(shù)的病毒基因結(jié)構(gòu)與功能的研究,是揭示BRSV致病機理、免疫保護機制以及病毒的宿主和組織嗜性等相關研究的基礎。本研究以BRSV核酸呈陽性的鼻拭子樣品LJX31為材料,對BRSV全長基因組進行序列測定,并進行序列同源性及進化樹分析,以確定中國流行的BRSV的遺傳進化關系。在此基礎上構(gòu)建BRSV反向遺傳質(zhì)粒系統(tǒng),可用于BRSV反向遺傳系統(tǒng)的建立,為BRSV的結(jié)構(gòu)與功能研究奠定基礎。全長基因組序列測定和分析結(jié)果顯示,LJX31全長基因組為15150 nt,5’端非編碼區(qū)為45 nt,3’端非編碼區(qū)為161 nt�；蚪M的編碼區(qū)位于46-14989 nt,包括NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L基因。L基因最大,含有6573 nt;NS2基因最小,含有492 nt;NS1、N、P、M、SH、G、F和M2基因全長依次為527、492、1202、869、950、466、840、1902和960 nt。全長基因組序列比對分析顯示,LJX31與美國Atue51908株的同源性為96.4%。LJX31的全長基因組存在13個核苷酸的插入和3個核苷酸的缺失。與Atue51908株相比,NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L基因的同源性為92.1-98.5%。對G蛋白的編碼基因序列進行同源性和遺傳進化分析顯示,LJX31與美國毒株V41的同源性最高、親緣關系最近,同源性達95.1%,表明LJX31可能來源于美國。為構(gòu)建BRSV LJX31的反向遺傳操作系統(tǒng),分別構(gòu)建了基因組全長cDNA質(zhì)粒,以及N、P、L和M2-1蛋白的真核表達質(zhì)粒;同時,為了增加拯救病毒對細胞的適應性,本研究構(gòu)建了BRSV受體蛋白CX3CR1的真核表達質(zhì)粒。N、P、L、M2-1和CX3CR1這5個蛋白表達質(zhì)粒作為輔助質(zhì)粒,與全長基因組cDNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BRSV易感細胞,可進行病毒的拯救。本研究同時構(gòu)建了基于T7啟動子和CMV啟動子的全長基因組cDNA質(zhì)粒PVK-LJX31和PCI-LJX31;N、P和M2-1蛋白的編碼基因直接克隆至PCI-neo載體,分別構(gòu)建表達質(zhì)粒PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1;L蛋白的編碼基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化后克隆至p3xflag-CMV載體,構(gòu)建表達質(zhì)粒p3xflag-YH-L;CX3CR1蛋白的編碼基因采用PCR方法從牛的肺組織中擴增獲得,直接克隆至PCI載體,構(gòu)建表達質(zhì)粒PCI-CX3CR1。PVK-LJX31、PCI-LJX31、PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1、p3xflag-YH-L和PCI-CX3CR1,經(jīng)酶切和序列分析確定序列正確,這樣BRSV LJX31反向遺傳系統(tǒng)所需的遺傳元件均獲得了相應的重組質(zhì)粒。采用IFA對PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1、p3xflag-YH-L進行表達驗證,結(jié)果顯示每個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后,其細胞內(nèi)表達產(chǎn)物均能與相應的抗體發(fā)生反應,表明質(zhì)粒均能在轉(zhuǎn)染細胞中獲得表達。此外,通過微基因組質(zhì)粒pok(-T7)-W對LJX31基因組的順式作用元件和調(diào)控區(qū)以及PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1和p3xflag-YH-L四個輔助質(zhì)粒的功能進行驗證,結(jié)果顯示,pok(-T7)-W質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后,再用BRSV感染細胞,可在細胞中表達綠色熒光蛋白,表明LJX31基因組的順式作用元件和調(diào)控區(qū)是有功能的;而pok(-T7)-W質(zhì)粒和PCI-N、PCI-P、PCI-M2-1和PCI-YH-L四個輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞時,卻不能夠在細胞中觀察到綠色熒光蛋白的表達,表明PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1和p3xflag-YH-L四個輔助質(zhì)粒形成RNP復合物的能力、或者RNP復合物的功能有缺陷。綜上所述,本研究對BRSV LJX31的全長基因組序列進行測定及分析,并構(gòu)建了該毒株反向遺傳操作系統(tǒng)的遺傳元件,包括基因組質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒及其功能鑒定的方法,為BRSV反向遺傳平臺的建立打下了堅實的基礎。
【圖文】：

中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第二章 牛呼吸道合胞體病毒反向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建的基礎研究2.1.7 輔助質(zhì)粒的構(gòu)建BRSV 拯救所必需的輔助質(zhì)粒包括 N、P、L 和 M2-1 四個蛋白的真核表達質(zhì)粒，此外為了增加拯救病毒的細胞適應性，本研究增加了一個BRSV受體CX3CR1的表達質(zhì)粒作為輔助質(zhì)粒之一。根據(jù)測定的 LJX31 基因組全長序列設計引物（表 2-4），，通過 PCR 的方式擴增 N、P 和 M2-1 三個蛋白編碼基因的開放閱讀框（ORF），并分別克隆至真核表達載體 PCI-neo-的 CMV 啟動子下游，分別命名為 PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1（圖 2-1）。利用天根公司的 DNA 提取試劑盒，從牛肺組織中獲得牛的基因組 DNA。設計引物（表 2-4）從牛的基因組 DNA 中擴增編碼受體蛋白 CX3CR1 的 ORF。將 CX3CR1 的 ORF 克隆至真核表達載體 PCI 的 CMV 啟動子下游（圖 2-1）。將構(gòu)建成的質(zhì)粒命名為 PCI-CX3CR1。

表 2-5 p3xflag-YH-L 構(gòu)建所使用的引物Table2-5 Primers used for the construction of p3xflag-YH-因片段 Primer sequence（5’-3-YH-1ACGACTCACTATAGGCAGCCAAGAGAACAGG-YH-2CAGTCCCTGTTCTCTTGGGTTCAGCTTGCAGAT-YH-3CCGACATCTGCAAGCTGGTCGACTCTAGAGG質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒以及全長基因組順式作用原件和調(diào)控區(qū)序列的功基因組由 LJX31 基因組的 5’NTR、3’NTR 以及完整 圖 2-2 p3xflag-YH-L 構(gòu)建示意圖ig.2-2 Schematic representation for the construction of p3xflag-Y
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.653

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本文編號：2602603