【摘要】：亞洲帶絳蟲(Taenia asiatica)是一種重要的人畜共患寄生蟲,成蟲寄生于人體腸道,幼蟲(囊尾蚴)主要寄生于豬肝臟和肌肉。亞洲帶絳蟲廣泛分布于亞洲各國,對人體健康和公共衛(wèi)生安全造成潛在危害。外泌體(Exosome)作為細(xì)胞分泌的一種新型的囊泡型通訊載體,可轉(zhuǎn)運細(xì)胞或寄生蟲等病原相關(guān)分子至受體細(xì)胞中,從而調(diào)控宿主的免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng),逃避宿主的免疫監(jiān)視。目前,尚未見有關(guān)亞洲帶絳蟲感染和免疫機理的報道,但推測其外泌體在蟲體與宿主小腸上皮細(xì)胞相互作用方面中發(fā)揮著重要作用。因此,本論文主要研究了亞洲帶絳蟲外泌體的分子特征,及其對終末宿主腸上皮細(xì)胞的影響。通過形態(tài)學(xué)觀察和線粒體CoxI及Cytb基因序列分析,將獲得的蟲體鑒定為亞洲帶絳蟲。體外培養(yǎng)亞洲帶絳蟲并收集其分泌排泄產(chǎn)物,采用差速離心法分離純化亞洲帶絳蟲外泌體。通過電鏡觀察和粒徑分析證明,純化的囊泡符合外泌體形態(tài)特征,說明成功獲得了亞洲帶絳蟲外泌體。利用蛋白質(zhì)譜及小RNA高通量測序技術(shù)分別分析外泌體所攜帶的蛋白質(zhì)及miRNA。結(jié)果表明,外泌體共攜帶455種蟲體蛋白,其中包含高豐度的代謝酶。免疫電鏡證明,烯醇化酶和14-3-3蛋白存在于外泌體中。小RNA測序分析發(fā)現(xiàn),外泌體中包含20個已知miRNA和5個新miRNA(reads300),RT-qPCR對外泌體和亞洲帶絳蟲成節(jié)中的9個miRNA進(jìn)行驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)外泌體中9個miRNA的相對豐度與小RNA測序結(jié)果基本一致,但外泌體對蟲體中不同的miRNA具有明顯的選擇性。miRNA靶基因預(yù)測及分析發(fā)現(xiàn),大量靶基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和細(xì)胞增殖。進(jìn)一步研究亞洲帶絳蟲外泌體對人結(jié)腸癌(LoVo)細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),PKH67綠色熒光染料標(biāo)記的外泌體可被LoVo細(xì)胞主動攝入。分別用表達(dá)Ad-mCherry-GFP-LC3B和Ad-mCherry-p62的重組腺病毒接種外泌體處理的LoVo細(xì)胞,激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn),外泌體處理組的細(xì)胞自噬被抑制。Western blotting檢測自噬標(biāo)志分子LC3B-Ⅱ、Beclin I和P62的表達(dá)水平,也顯示外泌體可抑制LoVo細(xì)胞自噬。同時還發(fā)現(xiàn),外泌體處理細(xì)胞的pAMPK/AMPK(p0.01)顯著降低,說明外泌體可能通過AMPK信號通路抑制細(xì)胞自噬。為明確亞洲帶絳蟲外泌體對LoVo細(xì)胞增殖和炎癥因子分泌的影響,首先用CCK8試劑盒檢測外泌體處理的LoVo細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)外泌體可顯著抑制細(xì)胞增殖。然后分別用RT-qPCR和蛋白芯片分析細(xì)胞及培養(yǎng)上清中炎癥因子的表達(dá)水平。結(jié)果表明,外泌體處理組細(xì)胞抗炎因子IL-13、IL-6和IL-33的表達(dá)水平明顯上調(diào)(p0.01),而促炎因子IL-1β及TNF-α的表達(dá)水平明顯下調(diào)(p0.01),且細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥因子的定量蛋白質(zhì)芯片檢測結(jié)果與qPCR的結(jié)果基本一致。表明外泌體可能抑制宿主細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。綜上所述,本研究首次證明絳蟲成蟲也可分泌外泌體,并攜帶大量與其他絳蟲蚴類似的蛋白和miRNA。亞洲帶絳蟲的外泌體被LoVo細(xì)胞攝入后,通過其釋放的內(nèi)容物,不僅可以抑制受體細(xì)胞的自噬和增殖,而且還可調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá),從而介導(dǎo)絳蟲與上皮細(xì)胞間的相互作用,創(chuàng)造適于絳蟲生活的腸道微環(huán)境。
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圖 1.1 外泌體的形成(Record et al., 2014b)Fig.1.1 The exosome formation離與鑒定定是外泌體研究的關(guān)鍵。目前，外泌體分離普遍采用的是差結(jié)合的方法(Record et al., 2014a; Sheldon et al., 2010)。高速離及其他與 EVs 共沉淀的雜質(zhì)，即可分離得到微囊泡和外泌更高的外泌體，則應(yīng)該采用密度梯度離心或免疫磁珠分選的泌體的提純方法現(xiàn)在主要有超速離心法、PEG 聚合物離心及u et al., 2017)。而外泌體鑒定的標(biāo)準(zhǔn)就是利用透射電子顯微TEM）及納米顆粒示蹤法（Nanoparticle tracking analysis, N徑大小分析。份種生物活性分子（圖1.2），主要成份包括脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。研份：參與細(xì)胞膜運輸和融合的蛋白質(zhì)，，如單體鳥苷三磷酸酶

有多糖分子，通常以大分子糖復(fù)合物的形式存在，如糖脂、蛋白聚糖類或翻譯后修飾的一些蛋白(Gerlach and Griffin, 2016)。圖1.2 外泌體的成份(Wubbolts et al., 2003a)Fig.1.2 The exosomes composition1.2.3 外泌體的功能病原體來源的外泌體可與宿主細(xì)胞以不同的方式發(fā)生相互作用。外泌體與靶細(xì)胞膜融合，可將上述異源性的生物活性物質(zhì)運輸?shù)绞荏w細(xì)胞中，并且選擇性地改變靶組織的生物學(xué)特性(Bucket al., 2014; Mittelbrunn et al., 2011; Montecalvo et al., 2012; Twu et al., 2018)。革蘭氏陰性菌來源的外泌體既可與細(xì)胞膜直接融合，又可以通過細(xì)胞內(nèi)吞的方式與宿主細(xì)胞融合。外泌體可靶向宿主細(xì)胞的膜蛋白并激活下游的信號通路，也能傳輸生物分子到細(xì)胞漿中，這為細(xì)胞間通訊提供了一種新的機制(Chen et al., 2019)。外泌體在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用，尤其是在介導(dǎo)細(xì)胞間通訊方面發(fā)揮重要功能，參與調(diào)控細(xì)胞發(fā)育與細(xì)胞遷移等一系列細(xì)胞生命周期活動(Colombo et al.,2014b; Zhang and Grizzle, 2011)。近年來，腫瘤相關(guān)外泌體的研究受到越來越多研究者的關(guān)注。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體及腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞分泌的外泌體
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.734

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2 楊毅梅;劉義;和康懷;藍(lán)春露;楊鈺寒;;驅(qū)出14條亞洲帶絳蟲的病例報告[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2009年03期

3 馬云祥;許熾q

本文編號：2599393