【摘要】：革蘭氏陰性菌已經(jīng)進(jìn)化出多種蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng),以輸出或輸入跨膜大分子來適應(yīng)環(huán)境和存活。2006年,VI型分泌系統(tǒng)(TypeⅥSecretion System,T6SS)首次在銅綠假單胞菌和霍亂弧菌中作為新型的細(xì)菌蛋白分泌系統(tǒng)被定義,并證明其與致病性有關(guān)且介導(dǎo)致病菌與宿主的相互作用。T6SS廣泛存在于約四分之一的革蘭氏陰性菌中,是一種多功能的注射裝置,可以將效應(yīng)分子傳遞至環(huán)境、真核宿主和原核競爭者。T6SS由跨膜復(fù)合物和類似噬菌體尾鞘的針管狀結(jié)構(gòu)組成。關(guān)于T6SS的結(jié)構(gòu)研究中,普遍認(rèn)為Hcp是T6SS的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)組分,以頭對頭或頭對尾的方式聚合形成環(huán)狀六聚體從而形成T6SS的內(nèi)管道,在鞘收縮時推動T6SS靶向細(xì)胞以輸送效應(yīng)蛋白。作為T6SS結(jié)構(gòu)重要組成部分的同時,Hcp的分泌作為T6SS發(fā)揮功能的標(biāo)志。有關(guān)細(xì)菌分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和機制研究已取得重大進(jìn)展。近年來,關(guān)于分泌系統(tǒng)在宿主-致病菌的互作中尤其是關(guān)于免疫應(yīng)答的復(fù)雜作用已成為研究熱點。細(xì)菌分泌系統(tǒng)傳送效應(yīng)分子來干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能,以一定的方式影響炎性小體通路。本研究中,PCN033是分離于病豬的腸外致病性大腸桿菌,通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)其含一套T6SS基因簇。如其他致病性大腸桿菌一樣,PCN033的基因組中有3個hcp拷貝,其中兩個位于T6SS基因簇內(nèi),另一個位于T6SS基因簇外,分別命名為hcp1、hcp2、hcp3。本實驗室已構(gòu)建了并保存了Δhcp1Δhcp2Δhcp3缺失株,hcp作為T6SS發(fā)揮功能的標(biāo)志,缺失hcp后,T6SS無法正常組裝進(jìn)而發(fā)揮作用,故本研究利用PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3兩個菌株,對PCN033感染后的宿主應(yīng)答及T6SS在激活炎癥過程中發(fā)揮的作用進(jìn)行了探究,主要內(nèi)容如下:1.RNA-seq檢測PCN033感染后RAW264.7的轉(zhuǎn)錄組變化選擇小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為PCN033的宿主細(xì)胞模型,對感染PCN033后宿主細(xì)胞RAW264.7內(nèi)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄組變化進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了508個差異表達(dá)的基因,對差異基因進(jìn)行功能分析,發(fā)現(xiàn)在GO數(shù)據(jù)庫中,與之相關(guān)且有統(tǒng)計學(xué)意義的涉及2052項生物過程、133種細(xì)胞組分、211個分子功能及52種KEGG代謝通路。差異基因參與的KEGG代謝通路中與天然免疫相關(guān)的有NF-κB、TNF、Apoptosis、TLR、NLR等信號通路。2.PCN033激活NF-κB信號通路和NLRP3、NLRC4炎性小體通過Western-blot檢測PCN033感染后RAW264.7中NF-κB信號通路的激活情況和胞內(nèi)蛋白NLRP3、NLRC4、ASC的表達(dá)情況。結(jié)果表明,隨著感染時間增加,p65發(fā)生磷酸化、IκBα降解,NLRP3、NLRC4及ASC的表達(dá)均明顯上調(diào)。這說明,PCN033感染后激活NF-κB信號通路和NLRP3、NLRC4炎性小體。3.T6SS在PCN033與宿主互作過程中的作用有文獻(xiàn)報道T6SS能夠促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。對細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)Δhcp1Δhcp2Δhcp3感染相對于PCN033感染后的細(xì)胞毒性顯著降低,表明了T6SS對小鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用有促進(jìn)作用。PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3以同樣的劑量靜脈注射小鼠后,通過ELISA測定小鼠血清中的IL-1β。發(fā)現(xiàn)相對于野毒株P(guān)CN033,缺失hcp后感染使得小鼠產(chǎn)生IL-1β的能力減弱,也就是說T6SS以一定的方式參與PCN033促進(jìn)IL-1β的釋放。進(jìn)一步,我們對炎性因子的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行q RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)T6SS對促炎因子IL-1β、IL-18、CXCL3、TNF-α的表達(dá)有上調(diào)作用,說明T6SS確實有一定的促炎作用。經(jīng)Western-blot檢測,發(fā)現(xiàn)PCN033感染促進(jìn)RAW264.7中caspase1的活化及pro-IL-1β的加工,且T6SS在此過程中發(fā)揮作用。另外我們發(fā)現(xiàn)T6SS參與PCN033感染激活宿主的NF-κB信號通路和NLRP3、NLRC4炎性小體。
【圖文】：

圖 1-1: T6SS 結(jié)構(gòu)及機制示意圖 (Cianfanelli et al . 1-1 Schematic representation of the structure and mechan量可變的基因簇編碼，所有的基因簇都包含13個功A-M，核心基因編碼形成分泌裝置基本結(jié)構(gòu)的蛋白ung 2007, Boyer et al 2009, Shneider et al 2013) 。另些核心組分的附加拷貝即hcp和vgrG。這些“孤兒效應(yīng)蛋白的基因附近 (Barret et al 2011, Maayer et因簇還編碼少量保守性不高的附屬蛋白和效應(yīng)因014a) 。位于T6SS基因簇內(nèi)外的所有毒性抗菌效應(yīng)，這些免疫蛋白特異性保護(hù)分泌細(xì)胞免受自身毒 (Russell et al 2014a) 。分泌系統(tǒng)的效應(yīng)因子述的 T6SS 的效應(yīng)因子是霍亂弧菌的 VgrG1，由 C

-2: T6SS 招募效應(yīng)因子示意圖 (Cianfanelli et al 2odes of Effector Delivery by the Type VI Secretio因子已經(jīng)被實驗證實或被預(yù)測有生化活性。真核或原核效應(yīng)物間是不同或共通的，通靶向真核宿主或競爭菌兩類。目前，，效應(yīng)因主相關(guān)細(xì)菌的競爭性生長優(yōu)勢或增加致病rand et al 2014, Russell et al 2014b, Alcofor。除了作為針對宿主或細(xì)菌競爭者的接觸依賴來清除輔因子以在氧化壓力下存活或促 et al 2017, Si et al 2017, Wan et al 2017) 。這適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的多樣化功能。 效應(yīng)因子的生物和生化功能是多樣化的。一細(xì)胞的細(xì)胞骨架相互作用�；魜y弧菌的 V癥有關(guān) (Pukatzki et al 2007, Ma and Mekal微管骨架相互作用，導(dǎo)致細(xì)菌成功侵襲上1) PAAR protein; (2) VgrG protein; (3) Hcp protein; (4) VgrG protein; (5) Hcp protein; (6) PAAR pro
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4

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