【摘要】：近些年,我國家禽養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)步發(fā)展,作為畜牧業(yè)中的重要一環(huán),家禽養(yǎng)殖已經(jīng)成為部分地區(qū)農(nóng)民的主要收入來源。家禽業(yè)養(yǎng)殖模式逐漸從散養(yǎng)轉(zhuǎn)向集約化和規(guī)�；�,在規(guī)�；B(yǎng)殖中家禽病毒性疾病的爆發(fā)往往造成巨大的損失,在引起家禽死亡率的病因中病毒所占比例達到36%,水禽則是很多病毒的攜帶者。干擾素是一種具有強大抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多功能生物活性的細胞因子,對病毒性疾病有很好的治療和預防效果。本研究采用基因工程的手段制備了鴨的Ⅰ型(α)、Ⅱ型(γ)和Ⅲ型(λ)干擾素,期望對鴨(禽)類病毒性疾病預防和治療提供幫助。本研究首先對鴨α、γ、λ干擾素的基因序列進行設計優(yōu)化,通過化學合成的方法獲得基因序列,將鴨α、γ、λ干擾素基因構建到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393的多克隆位點中,獲得重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-DuIFN-α、pVL1393-DuIFN-γ和pVL1393-DuIFN-λ,將重組轉(zhuǎn)移載體與失活拯救型家蠶桿狀病毒穿梭質(zhì)粒reBmBac共轉(zhuǎn)染BmN細胞,收集重組病毒rBmBac-DuIFN-α、rBmBac-DuIFN-γ、rBmBac-DuIFN-λ,用重組病毒感染家蠶幼蟲并收獲表達產(chǎn)物,并通過PCR、RT-PCR的方法證明了三種干擾素基因均重組到了家蠶桿狀病毒基因組中,且隨著病毒基因組在家蠶幼蟲體內(nèi)進行了復制和高效的轉(zhuǎn)錄。其次,本研究利用CEF/VSV-GFP系統(tǒng)對蠶血淋巴中的鴨α、γ、λ干擾素進行了抗病毒活性檢測,即采用微量細胞病變抑制法,在CEF細胞上檢測蠶血淋巴中的鴨干擾素對VSV-GFP病毒增殖的抑制效果,抗病毒結果顯示蠶血淋巴中表達的重組鴨α、γ、λ干擾素都具有較強的抗病毒活性,重組鴨α、γ、λ干擾素抗病毒效價分別為8.13×10~5U/mL、3.0×10~5U/mL、6.1×10~5U/mL。最后通過空斑篩選對共轉(zhuǎn)染病毒進行純化,分別獲得了高表達三種干擾素的病毒毒種,重組鴨α干擾素效價為(1.9±0.25)×10~6 U/mL,重組鴨γ干擾素效價為(8.65±0.52)×10~5U/mL,重組鴨λ干擾素效價為(1.56±0.1)×10~6U/mL,與未經(jīng)純化的重組病毒相比,純化后的最高表達量的毒株所表達的干擾素效價均有2~3倍的提高。本研究利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)對鴨的α、γ、λ干擾素進行了高效表達,經(jīng)檢測均由較強抗病毒活性。為廉價鴨(禽)用干擾素的生產(chǎn)奠定了基礎,期待對鴨(禽類)病毒性疾病的防控和治療有所幫助。
【圖文】：

圖 1 干擾素受體信號通路（引自參考文獻[25]）Fig.1 The signaling pathway of interferon receptor 干擾素的生物學活性.1 抗病毒作用干擾素最早被發(fā)現(xiàn)的功能就是其對病毒復制的抑制作用，但是后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)素并不直接作用于病毒，而是通過受體激活下游的通路，誘導激活 ISGs 轉(zhuǎn)錄表抗病毒蛋白（antiviral proteins）來完成對病毒的抑制作用。干擾素誘導的 ISGs 多種，但是其轉(zhuǎn)錄翻譯的終產(chǎn)物中目前只有蛋白激酶（PKR）、寡腺苷酸合成S）、黏病毒抗性蛋白（MxA）及 15KDa 的 ISG（IFN-stimulated protein of 15KD5）、病毒抑制蛋白（Viperin）幾種研究比較深入[25]。PKR[27]是組成型表達的狀態(tài)下有少量存在，，但可由 IFN 進一步誘導表達，當 PKR 與病毒的 dsRNA 結會磷酸化翻譯起始因子 eIF2α，從而抑制細胞和病毒 mRNA 的翻譯，抑制病毒KR 可以特異性地識別并結合病毒相關的 RNA，猜測這種方式可能是機體早期抗病毒反應的關鍵步驟[28]。OAS 可與病毒 dsRNA 結合，產(chǎn)生 2’-5’寡腺苷酸，

24密碼子適應指數(shù)；B：DuIFN-γ基因的密碼子適應指數(shù)；C碼子適應指數(shù)A: CAI of DuIFN-α; B: CAI of DuIFN-γ; C: CAI of DuIFN-λ圖 2.1 DuIFN-α、DuIFN-γ和 DuIFN-λ基因的密碼子適應指數(shù)Fig .2.1 CAI of DuIFN-α、DuIFN-γ and DuIFN-λ基因中 GC 含量的也是影響其表達的一個重要因素，，在對核苷酸序列進行密碼子優(yōu)化時將 DuIFN-α、D調(diào)整為 53.93%、53.11%和 58.86%，見圖 2.2。
【學位授予單位】：江蘇科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.3

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本文編號：2597191