【摘要】：近些年,我國(guó)家禽養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)步發(fā)展,作為畜牧業(yè)中的重要一環(huán),家禽養(yǎng)殖已經(jīng)成為部分地區(qū)農(nóng)民的主要收入來(lái)源。家禽業(yè)養(yǎng)殖模式逐漸從散養(yǎng)轉(zhuǎn)向集約化和規(guī)�；�,在規(guī)�；B(yǎng)殖中家禽病毒性疾病的爆發(fā)往往造成巨大的損失,在引起家禽死亡率的病因中病毒所占比例達(dá)到36%,水禽則是很多病毒的攜帶者。干擾素是一種具有強(qiáng)大抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多功能生物活性的細(xì)胞因子,對(duì)病毒性疾病有很好的治療和預(yù)防效果。本研究采用基因工程的手段制備了鴨的Ⅰ型(α)、Ⅱ型(γ)和Ⅲ型(λ)干擾素,期望對(duì)鴨(禽)類病毒性疾病預(yù)防和治療提供幫助。本研究首先對(duì)鴨α、γ、λ干擾素的基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化,通過(guò)化學(xué)合成的方法獲得基因序列,將鴨α、γ、λ干擾素基因構(gòu)建到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393的多克隆位點(diǎn)中,獲得重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-DuIFN-α、pVL1393-DuIFN-γ和pVL1393-DuIFN-λ,將重組轉(zhuǎn)移載體與失活拯救型家蠶桿狀病毒穿梭質(zhì)粒reBmBac共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞,收集重組病毒rBmBac-DuIFN-α、rBmBac-DuIFN-γ、rBmBac-DuIFN-λ,用重組病毒感染家蠶幼蟲并收獲表達(dá)產(chǎn)物,并通過(guò)PCR、RT-PCR的方法證明了三種干擾素基因均重組到了家蠶桿狀病毒基因組中,且隨著病毒基因組在家蠶幼蟲體內(nèi)進(jìn)行了復(fù)制和高效的轉(zhuǎn)錄。其次,本研究利用CEF/VSV-GFP系統(tǒng)對(duì)蠶血淋巴中的鴨α、γ、λ干擾素進(jìn)行了抗病毒活性檢測(cè),即采用微量細(xì)胞病變抑制法,在CEF細(xì)胞上檢測(cè)蠶血淋巴中的鴨干擾素對(duì)VSV-GFP病毒增殖的抑制效果,抗病毒結(jié)果顯示蠶血淋巴中表達(dá)的重組鴨α、γ、λ干擾素都具有較強(qiáng)的抗病毒活性,重組鴨α、γ、λ干擾素抗病毒效價(jià)分別為8.13×10~5U/mL、3.0×10~5U/mL、6.1×10~5U/mL。最后通過(guò)空斑篩選對(duì)共轉(zhuǎn)染病毒進(jìn)行純化,分別獲得了高表達(dá)三種干擾素的病毒毒種,重組鴨α干擾素效價(jià)為(1.9±0.25)×10~6 U/mL,重組鴨γ干擾素效價(jià)為(8.65±0.52)×10~5U/mL,重組鴨λ干擾素效價(jià)為(1.56±0.1)×10~6U/mL,與未經(jīng)純化的重組病毒相比,純化后的最高表達(dá)量的毒株所表達(dá)的干擾素效價(jià)均有2~3倍的提高。本研究利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)鴨的α、γ、λ干擾素進(jìn)行了高效表達(dá),經(jīng)檢測(cè)均由較強(qiáng)抗病毒活性。為廉價(jià)鴨(禽)用干擾素的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ),期待對(duì)鴨(禽類)病毒性疾病的防控和治療有所幫助。
【圖文】：

圖 1 干擾素受體信號(hào)通路（引自參考文獻(xiàn)[25]）Fig.1 The signaling pathway of interferon receptor 干擾素的生物學(xué)活性.1 抗病毒作用干擾素最早被發(fā)現(xiàn)的功能就是其對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用，但是后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)素并不直接作用于病毒，而是通過(guò)受體激活下游的通路，誘導(dǎo)激活 ISGs 轉(zhuǎn)錄表抗病毒蛋白（antiviral proteins）來(lái)完成對(duì)病毒的抑制作用。干擾素誘導(dǎo)的 ISGs 多種，但是其轉(zhuǎn)錄翻譯的終產(chǎn)物中目前只有蛋白激酶（PKR）、寡腺苷酸合成S）、黏病毒抗性蛋白（MxA）及 15KDa 的 ISG（IFN-stimulated protein of 15KD5）、病毒抑制蛋白（Viperin）幾種研究比較深入[25]。PKR[27]是組成型表達(dá)的狀態(tài)下有少量存在，，但可由 IFN 進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)，當(dāng) PKR 與病毒的 dsRNA 結(jié)會(huì)磷酸化翻譯起始因子 eIF2α，從而抑制細(xì)胞和病毒 mRNA 的翻譯，抑制病毒KR 可以特異性地識(shí)別并結(jié)合病毒相關(guān)的 RNA，猜測(cè)這種方式可能是機(jī)體早期抗病毒反應(yīng)的關(guān)鍵步驟[28]。OAS 可與病毒 dsRNA 結(jié)合，產(chǎn)生 2’-5’寡腺苷酸，

24密碼子適應(yīng)指數(shù)；B：DuIFN-γ基因的密碼子適應(yīng)指數(shù)；C碼子適應(yīng)指數(shù)A: CAI of DuIFN-α; B: CAI of DuIFN-γ; C: CAI of DuIFN-λ圖 2.1 DuIFN-α、DuIFN-γ和 DuIFN-λ基因的密碼子適應(yīng)指數(shù)Fig .2.1 CAI of DuIFN-α、DuIFN-γ and DuIFN-λ基因中 GC 含量的也是影響其表達(dá)的一個(gè)重要因素，，在對(duì)核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化時(shí)將 DuIFN-α、D調(diào)整為 53.93%、53.11%和 58.86%，見(jiàn)圖 2.2。
【學(xué)位授予單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.3

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本文編號(hào)：2597191