發(fā)布時(shí)間：2020-03-22 20:31

【摘要】：全球廣泛流行的低致病性H9N2亞型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)可引起家禽、野鳥和部分哺乳動(dòng)物感染H9N2亞型禽流感(Avian Influenza,AI)。水禽不單是AIV的天然宿主,還是候鳥與家禽間病毒傳播的重要媒介。AIV基因易發(fā)生突變和重組,導(dǎo)致毒力、親嗜性和抗原性發(fā)生變化,并成為其他亞型流感病毒重組基因的供體。密切跟蹤本病毒的變異動(dòng)態(tài),篩選疫苗候選株,對(duì)禽流感防控及維護(hù)公共衛(wèi)生安全具有重要意義。本試驗(yàn)自2015年10月至2017年3月在廣東佛山某活禽交易市場(chǎng)采集的469份拭子樣品中分離獲得6株H9N2亞型AIV。對(duì)6株分離株病毒作全基因測(cè)序,應(yīng)用生物軟件分析序列,結(jié)果表明,各分離株HA和NA基因來(lái)源于BJ94亞系,6株病毒HA蛋白裂解位點(diǎn)附近的氨基酸序列均符合低致病性毒株特征(2株為PARSSR↓GL,4株為PSRSSR↓GL)。4株分離株HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)出現(xiàn)Q226L(H3編號(hào))的變化,存在結(jié)合人α2,6-唾液酸受體傾向性。6株分離株均出現(xiàn)NA莖部區(qū)域氨基酸缺失。PB2、M基因來(lái)源于G1亞系,M2蛋白出現(xiàn)S31N位點(diǎn)突變,提示存在對(duì)金剛烷胺和金剛乙胺耐藥特性。PB1、PA、NP、NS基因來(lái)源于F98亞系,6株病毒NS1蛋白出現(xiàn)P42S位點(diǎn)的突變,使得病毒可頡頏宿主體內(nèi)干擾素的產(chǎn)生。分析顯示6株病毒內(nèi)部基因與人類流感H7N9、H10N8、H5N6亞型的內(nèi)部基因相似性較高,提示分離毒與上述人類病毒之間可能存在基因重組現(xiàn)象。試驗(yàn)對(duì)鵝源A/Goose/Guangdong/A11/2016(H9N2)(GS/A11)株的相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果顯示,雞胚最小致死量的平均死亡時(shí)間(MDT)為120 h,該毒株對(duì)雞胚半數(shù)感染量(EID_(50))為10~(-8.632)/0.1 mL。為了解H9N2對(duì)鵝的致病性,以10~6EID_(50)劑量經(jīng)靜脈注射6周齡雛鵝(流感抗體陰性),攻毒顯示,試驗(yàn)鵝無(wú)明顯臨床癥狀,但排毒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)可經(jīng)喉氣管和泄殖腔排毒。對(duì)攻毒鵝的氣管進(jìn)行病理組織學(xué)觀察和病毒分布觀察,結(jié)果表明,攻毒鵝氣管黏膜結(jié)構(gòu)被破壞,上皮細(xì)胞變性壞死、脫落、少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);免疫組化可見感染鵝氣管黏膜上皮細(xì)胞中有病毒陽(yáng)性信號(hào)。試驗(yàn)為了解鵝源GS/A11株對(duì)鵝的免疫原性,將GS/A11株制成油乳滅活疫苗,對(duì)鵝作免疫試驗(yàn),結(jié)果表明,在一次免疫后第2周免疫鵝開始產(chǎn)生抗體,在二次免疫后第4周平均抗體水平達(dá)到峰值(8.1 log2)。取毒株GS/A11制備的特異性血清和H9N2亞型AIV早期代表株A/Chicken/Shanghai/10/01(H9N2)(SH10)血清(購(gòu)買于哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司)分別與分離的6株H9N2毒株和代表株SH10作交叉HI試驗(yàn),HI交叉試驗(yàn)結(jié)果表明6株分離株與代表株的抗原性存在差異。本試驗(yàn)構(gòu)建鵝源GS/A11株的HA蛋白進(jìn)行原核表達(dá)系統(tǒng)、并優(yōu)化表達(dá)條件。對(duì)獲得的HA蛋白進(jìn)行純化、Western blot驗(yàn)證。Western Blot試驗(yàn)結(jié)果顯示在56 k Da位置出現(xiàn)一條清晰的蛋白印跡,表明成功原核表達(dá)獲得H9 HA蛋白,為實(shí)驗(yàn)室研究H9N2亞型AIV HA蛋白相關(guān)的下游試驗(yàn)(單克隆抗體制備、亞單位疫苗的研究、重組活載體疫苗的研究等)提供一定基礎(chǔ)。課題研究為探究H9N2 AIV近期流行進(jìn)化要點(diǎn),明確其在禽流感傳播與突變過(guò)程的作用及其疫苗候選株的選擇提供了依據(jù)。
【圖文】：

毒分子特征結(jié)構(gòu)特征驗(yàn)室多次傳代后病毒粒子一般呈球形，直徑為 80約 1％的 RNA，5％～8％的碳水化合物，20％的脂組結(jié)構(gòu)特征由 8 個(gè)單股 RNA 片段組成（圖 1-1），共編碼 17 （PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1-F2、N40、PA-X、PA-N155、PA-N182、M42、NS殊性，，不同禽流感病毒感染同一宿主時(shí)，就可能新的流行株，例如 1957 年和 1968 年的人類流感

M：DL 5000 DNA Marker；1-6：6 株病毒；7：陰性對(duì)照?qǐng)D 3-1 6 株 H9 AIV 特異性引物的 PCR 產(chǎn)物凝膠電泳圖.2 6 株 H9 亞型禽流感病毒全基因 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果6 株病毒的 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS 全基因通過(guò) RT-PCR 擴(kuò)增脂糖凝膠電泳，可見擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小分別約為 2 300 bp、2 300 bp、2 200 bp、1 p、1 600 bp、1 400 bp、1 000 bp 和 900 bp，相應(yīng)基因 PCR 產(chǎn)物條帶與預(yù)測(cè)分子量一致，擴(kuò)增圖如 3-2、3-3 所示。把目的基因片段連接到 18T 載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)中，對(duì)鑒定為陽(yáng)性克隆菌菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提,對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，最終獲得 6 株 H9N型 AIV 全基因組序列，6 株分離株命名見表 3-1。
【學(xué)位授予單位】：佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

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