【摘要】：雞球蟲病是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的寄生原蟲病,該病的防治主要采用在飼料中添加化學(xué)藥物和疫苗免疫預(yù)防兩種方法。目前在臨床上應(yīng)用的雞球蟲病疫苗包括活疫苗和亞單位疫苗兩大類�；钜呙缬职ǘ疽呙绾腿醵疽呙鐑纱箢�,由于弱毒疫苗的蟲株毒力低,免疫后不引起不良反應(yīng)或反應(yīng)輕,所以更受養(yǎng)殖戶青睞。亞單位疫苗的生產(chǎn)需從感染的雞體內(nèi)分離純化配子體,然后再用親和柱層析的方法分離純化配子體蛋白,因此生產(chǎn)費時、成本昂貴。利用基因重組技術(shù)研制基因工程疫苗可能解決這一難題。毒害艾美耳球蟲(Eimeria necatrix)是雞球蟲病的重要病原,在臨床上常危害8～18周齡的雞,引起雞的急性小腸球蟲病。近年來,在我國隨著生長周期較長的黃羽雞飼養(yǎng)數(shù)量的不斷攀升,以及采用地面平養(yǎng)方式,使得由毒害艾美耳球蟲引起的球蟲病呈上升趨勢,給養(yǎng)雞業(yè)帶來很大的經(jīng)濟損失。為此,本研究采用早熟選育的方法培育毒害艾美耳球蟲減毒株,同時應(yīng)用基因工程技術(shù)原核表達毒害艾美耳球蟲配子體蛋白Engam59基因,純化表達產(chǎn)物,進行動物免疫保護試驗,評價重組配子體抗原的免疫保護力以及早熟株的免疫原性,旨在為雞球蟲病減毒疫苗和基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。1毒害艾美耳球蟲單卵囊蟲株的建立其PCR鑒定分離毒害艾美耳球蟲單個卵囊,感染3日齡無球蟲雛雞,收集雞糞便中卵囊,培養(yǎng)孢子化后感染雛雞擴增卵囊;卵囊孢子化后再感染無球蟲雛雞,觀察腸道病變、蟲體寄生部位以及卵囊形態(tài)。以4種雞球蟲實驗室保存株(毒害、巨型、柔嫩、堆型艾美耳球蟲)的基因組DNA為模板,分別用針對4種球蟲的ITS-1序列設(shè)計的種特異性引物進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析,觀察特異性條帶。根據(jù)腸道病變、蟲體寄生部位和卵囊形態(tài)特征,鑒定單卵囊分離株為毒害艾美耳球蟲,其潛在期為156 h。PCR結(jié)果顯示,只有在模板和擴增引物為同一種球蟲時,方能擴增出特異性條帶,表明本室保存的4種雞球蟲均為純種株。2毒害艾美耳球蟲的早熟株選育以毒害艾美耳球蟲單卵囊分離株為親本株,采用早熟株選育方法選育毒害艾美耳球蟲早熟株。經(jīng)26代早熟選育后,再連續(xù)傳代2次,擴增卵囊。擴增卵囊培養(yǎng)孢子化后,以0.5 × 104、1 × 104、3 × 104、5 × 104個/羽的劑量感染14日齡雛雞,同時設(shè)親本株為對照組,以平均體重、死亡率和腸道病變記分為指標(biāo),評價早熟株的致病性。結(jié)果顯示,經(jīng)26代早熟選育后潛在期從156h縮短到140h,早熟株與親本株相比致病性明顯減弱。3毒害艾美耳球蟲配子體Engam59基因的原核表達根據(jù)Engam59基因的ORF序列和質(zhì)粒pET-28a(+)酶切位點設(shè)計引物,以重組質(zhì)粒pGEM-T-Easy-gam59為模板擴增出表達片段,大小為1419 bp(已除掉信號肽部分)。將該基因片段與載體pET-28a(+)連接,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-gam59。重組質(zhì)粒pET-28a(+)-gam59轉(zhuǎn)化BL21,誘導(dǎo)表達。融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析顯示大小為57 kDa左右,Western blot分析顯示重組蛋白能被抗6 × HIS標(biāo)簽單抗特異性識別�？扇苄苑治鲲@示重組蛋白以包涵體存在。用純化的重組蛋白免疫小鼠制備多抗,以制備的抗重組蛋白鼠多抗為一抗,Western blot檢測毒害艾美耳球蟲配子體蛋白,見有一大小為56kDa左右的特異性條帶。結(jié)果表明體外重組表達配子體蛋白rEnGAM59具有較好的免疫原性。4毒害艾美耳球蟲重組配子體蛋白rEnGAM59的免疫保護效果以雛雞為試驗動物,卵囊減少率、病變記分、平均增重等為指標(biāo),評價重組蛋白rEnGAM59的免疫保護效果,并檢測免疫后產(chǎn)生的特異性抗體水平。結(jié)果顯示,與未免疫攻蟲組相比,重組蛋白rEnGAM59在一定程度上能降低卵囊產(chǎn)量與減輕病變記分,提高平均增重,但不能達到卵囊免疫組的免疫保護水平。早熟株卵囊免疫組與親本株卵囊免疫組的免疫保護效果相近,無顯著差異。
【圖文】：

３結(jié)果逡逑３．邋１單卵囊分離株的卵囊形態(tài)逡逑卵囊呈長卵圓形，壁光滑，，無卵膜孔和卵囊殘體，有極體（圖１－１）。測１００個孢子逡逑化卵囊，大小為邋１２．５０邋￣邋３０．００邋ｐｍ邋ｘ邋１２．５０邋￣邋２２．５０邋（ａｍ，平均大小為邋１７．５０邋ｎｍ邋ｘ邋１４．５５逡逑形狀指數(shù)為１．２０。孢子囊呈長卵圓形，有斯氏體，無孢子囊殘余體，測１００個孢子囊大小逡逑為邋９．００？１４．００叫１＞＜４．００？７．１０｜ａｍ，平均大小邋ｉａ９１（ａｍｘ５．９１ｐｍ，與文獻相符［１’５］。逡逑＿逡逑圖１－１毒害艾美耳球蟲卵囊逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｏｏｃｙｓｔｓ邋ｏｆ邋Ｅ．邋ｎｅｃａｔｒｉｘ逡逑３．邋２單卵囊分離株的潛在期逡逑攻蟲后第５天開始進行糞檢，每隔２邋ｈ進行一次。在１５６邋ｈ查見卵囊排出，故該毒害逡逑艾美耳球蟲的潛在期為１５６小時。逡逑３．邋３單卵囊分離株的寄生部位和腸道病變逡逑剖檢感染雞，發(fā)現(xiàn)整個小腸，尤其是卵黃蒂前后，漿膜面可見針尖狀出血點，腸管明逡逑顯腫脹（圖１－２），打開腸腔見腸內(nèi)容物混有較多血凝塊，腸黏膜脫落，刮取腸黏膜涂片逡逑鏡檢發(fā)現(xiàn)大量的巨型裂殖體，卵囊僅見于盲腸黏膜中。逡逑

ｃ：邋Ｅ．邋ｍａｘｉｍａ邋ｓｐｏｒａｔｅｄ邋ｏｏｃｙｓｔｓ；邋ｄ：邋Ｅ．邋ａｃｅｎ＾ｕｌｉｎａ邋ｓｐｏｒｕｌａｔｅｄ邋ｏｏｃｙｓｔｓ逡逑３．邋３邋ＰＣＲ產(chǎn)物電泳檢測逡逑ＰＣＲ產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果見圖１－４￣７。以毒害艾美耳球蟲的ＤＮＡ為模板，分別用毒逡逑害、柔嫩、巨型和堆型艾美耳球蟲的引物進行ＰＣＲ擴增，結(jié)果僅在用毒害艾美耳球蟲引逡逑物進行ＰＣＲ擴增的產(chǎn)物中見有特異性條帶，其他３種球蟲的引物未能擴增出條帶。而當(dāng)逡逑以柔嫩艾美耳球蟲的ＤＮＡ模板時，用柔嫩艾美耳球蟲引物進行ＰＣＲ擴增可見有特異性逡逑條帶（圖１－４）。逡逑以柔嫩艾美耳球蟲的ＤＮＡ為模板，分別用柔嫩、巨型、堆型和毒害艾美耳球蟲的引逡逑物進行ＰＣＲ擴增，結(jié)果僅在用柔嫩艾美耳球蟲引物進行ＰＣＲ擴增的產(chǎn)物中見有特異性條逡逑帶，其他３種球蟲的引物未能擴增出條帶。而當(dāng)以毒害艾美耳球蟲的ＤＮＡ模板時，用毒逡逑害艾美耳球蟲引物進行ＰＣＲ擴增可見有特異性條帶（圖卜５）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.723

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