【摘要】：表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)是一種能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化的小分子多肽,在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)一系列的生理過程中扮演重要的角色。人們?cè)谘芯坎溉閯?dòng)物的EGF時(shí)發(fā)現(xiàn)其可影響動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、免疫功能及腸道發(fā)育,但是目前有關(guān)雞表皮生長(zhǎng)因子(gallus epidermal growth factor,gEGF)的研究卻很少有提及,而雛雞抵抗力較弱,其生長(zhǎng)發(fā)育易受到不良條件的影響,因此本試驗(yàn)擬采用乳酸乳球菌非抗性篩選表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行外源表達(dá)gEGF,并通過體內(nèi)外試驗(yàn)對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究。以下是研究?jī)?nèi)容及結(jié)果。人工合成SP_(usp45)和gEGF融合基因片段,將此目的基因克隆至表達(dá)載體pNZ8149,之后電轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌NZ3900,獲得了能夠分泌表達(dá)gEGF的工程菌LL-pNZ8149-gEGF,重組工程菌經(jīng)Nisin誘導(dǎo)后,利用Western blot和SDS-PAGE檢測(cè)到菌體和上清中表達(dá)的蛋白,此外,還利用HisTrap柱成功從上清中純化出gEGF蛋白。體外培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞UMNSAH/DF-1至單層細(xì)胞的60%左右后饑餓培養(yǎng)12 h,之后以不同濃度的gEGF蛋白溶液分別刺激UMNSAH/DF-1細(xì)胞,觀察gEGF對(duì)UMNSAH/DF-1細(xì)胞的增殖活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),1-10μg/mL gEGF均可顯著促進(jìn)UMNSAH/DF-1細(xì)胞的增殖,5μg/mL gEGF的促進(jìn)作用最強(qiáng)。以5 d齡雛雞作為試驗(yàn)動(dòng)物,將其分為3組,每組每日分別灌服1ml M17培養(yǎng)基、LL-pNZ8149誘導(dǎo)上清液、LL-pNZ8149-gEGF誘導(dǎo)上清液,連續(xù)灌服2周,記錄每天的采食量、體重,計(jì)算1周及2周內(nèi)平均日采食量、平均日增重以及料肉比,以此作為評(píng)價(jià)gEGF對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能影響的依據(jù),結(jié)果發(fā)現(xiàn):gEGF可顯著提高肉雞末重、平均日增重、平均日采食量以及2周內(nèi)的料肉比;2周后處死雞群,取出免疫器官脾臟、胸腺、法氏囊,計(jì)算免疫器官指數(shù),翅靜脈采血檢測(cè)血清IgG、IgA水平,之后分別刮取十二指腸、空腸、回腸黏膜測(cè)定黏膜sIgA水平,以此作為評(píng)價(jià)gEGF對(duì)肉雞免疫功能影響的依據(jù),結(jié)果發(fā)現(xiàn):gEGF可顯著提高胸腺、脾臟指數(shù)以及血清IgG、IgA以及十二指腸黏膜sIgA水平;此外,2周后分別取十二指腸、空腸、回腸組織制作組織切片,分析各腸段絨毛高度,隱窩深度的變化,以此作為評(píng)價(jià)gEGF對(duì)肉雞腸道發(fā)育影響的依據(jù),結(jié)果發(fā)現(xiàn):gEGF可顯著提高十二指腸,空腸絨毛高度,降低十二指腸隱窩深度。本試驗(yàn)成功實(shí)現(xiàn)了gEGF在乳酸乳球菌非抗性篩選表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá),所表達(dá)的產(chǎn)物具有促進(jìn)UMNSAH/DF-1細(xì)胞增殖的活性,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,gEGF具有改善肉雞的生長(zhǎng)性能,提高免疫功能以及促進(jìn)腸道發(fā)育的作用。
【圖文】：

雞表皮生長(zhǎng)因子在乳酸乳球菌中的表達(dá)及初步應(yīng)用生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor, EGF）（圖 1）是一種促小分子多肽，Cohen 等最先從小鼠頜下腺中發(fā)現(xiàn)并分離得 mEGF），之后測(cè)定其一級(jí)結(jié)構(gòu)序列后發(fā)現(xiàn)，mEGF 是由 5約為 6k Da 左右，由于其中含有 3 對(duì)二硫鍵，因此其對(duì)酸Cohen et el 1962）。除促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化外，EGF 還胃液的分泌、調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育以及參與內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的表明腫瘤的發(fā)生也與 EGF 有關(guān)。由于 EGF 在機(jī)體內(nèi)具有的應(yīng)用前景，EGF 正受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文要分布于上皮細(xì)胞，包含 3 部分：細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，其胞膜外結(jié)構(gòu)域含有多對(duì)二硫鍵，EGF 可與之結(jié)合（Carpenter et al 1990）。 EGFR 的細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，使得 EGFR 構(gòu)象發(fā)生變化，形成二聚體復(fù)合起 EGFR 胞內(nèi)區(qū)末端的酪氨酸殘基磷酸化，從而激活一系列下游信號(hào)通路（圖信號(hào)傳入核內(nèi)，促進(jìn) DNA 和蛋白質(zhì)的合成，，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖（Marqu1999），在這之后，信號(hào)被滅活，二聚體復(fù)合物降解或轉(zhuǎn)移至細(xì)胞表面（Sebaal 2006）。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S831

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本文編號(hào)：2595187